|
Toksiske effekter af pulseksponering af pesticider - akutte og kroniske effekter hos Daphnia magna 2 Udvalgte pesticider og forsøgsorganisme
2.1 Pesticidforbrug og -fund i vandmiljøet i DanmarkPesticider er kemiske forbindelser, der bruges til at kontrollere forskellige former for skadevoldere i bl.a. landbruget. Pesticiderne inddeles således i grupper afhængig af den målgruppe, de bl.a. anvendes imod, og i Danmark er herbicider (mod plantevækst), fungicider (mod svampevækst) og insekticider (mod insekter) de hyppigst anvendte. Nogle pesticider er i sig selv tilstrækkelig vandopløselige til at blive opløst og sprøjtet ud i vand, men oftest formuleres de som emulgerbare koncentrater eller som granulater (Walker et al., 1996). Salget af pesticider i Danmark er blevet reduceret fra 6169 tons i 1993 til 3554 tons i 2003, hvilket svarer til et fald på 42%. Faldet skyldes et forsøg på at minimere forekomsten af pesticider i grundvand og vandmiljø. Figur 1 viser fordelingen af salget af pesticider i Danmark i 2003. Det ses at herbicider udgør de mest solgte pesticider herhjemme med 2390 tons virksomt stof, svarende til 67 % af den samlede mængde solgte pesticider (Danmarks Statistik, 2004). Eksempler på hvordan pesticider kan tilføres søer og vandløb kan være: Drift fra udbringning på marker eller punktkilder som vaske eller spulepladser, hvor tømningen og rengøring af tanke og sprøjter foregår. Ligeledes udgør afløb fra dræn samt afstrømningen fra overflader under kraftige regnskyl kildet til pesticider i vandløb. Wiberg-Larsen et al. (1991) skønnede, på baggrund af Fyns Amts vandløbsforureningsrapporter for årene 1988-1990, at ca. 80 km vandløbsstrækning i Fyns Amt årligt forurenes med plantebeskyttelsesmidler. Generelt vil mindre vandløb have en mindre vandføring, og dermed være mere sårbare overfor forureninger end større vandløb, men billedet kan variere betydeligt i forskellige dele af landet.
Figur 1: Det samlede pesticidsalg (ton virksomt stof) i Danmark i 2003 fordelt over pesticidtype (Danmarks Statistik, 2004). I en oversigt over pulskoncentrationer af pesticider fundet i vandløb i Fyns, Århus og Nordjyllands Amt nævnes koncentrationer i vandløb på mellem 0,02 μg/l og 10,0μg/l (Styczen et al., 2003). Blandt de pesticider, der er testet i nærværende projekt, er stofferne dimethoat (0,7 μg/l), pirimicarb (3,0 μg/l), esfenvalerat (0,66 μg/l) og bromoxynil (10 μg/l) påvist og kvantificeret i de angivne maksimumskoncentrationer. Lauridsen & Wiggers (2001) undersøgte ligeledes koncentrationen af pesticider ved normal vandføring og under regnvejrshændelser og fandt koncentrationer mellem detektionsgrænsen på 0,01 μg/l og 5,1 μg/l. Desuden har Lauridsen et al. (2003) opstillet en liste over koncentrationen af en række pesticider i søer og vandhuller, baseret på undersøgelser foretaget af Århus-, Ringkøbing- og Ribe Amt hvoraf det fremgår at koncentrationen i søer ligger i intervallet 0,01-0,09μg/l og i vandhuller i intervallet 0,02-0,92μg/l. 2.2 Undersøgte pesticiderTabel 1 viser de pesticider, der er undersøgt i nærværende projekt, samt fysisk-kemiske parametre for disse. De undersøgte pesticider og referencestoffer er udvalgt i samråd med Miljøstyrelsen, bl.a. ud fra kriterier om anvendelsen i Danmark. I det følgende vil stoffernes virkemekanismer og brug kort blive gennemgået gruppevist, ligesom der også vil blive givet en vurdering af stoffernes skæbne i det anvendte testsystem (se afsnit 2.3). Det skal nævnes, at stoffet diflubenzuron (CAS nr. 35367-38-5) oprindelig var inkluderet i undersøgelserne, men at stoffet efter indledende forsøg udgik, da der ikke kunne observeres effekter på dafniernes mobilitet i koncentrationer op til stoffets vandopløselighed. Tabel 1: Anvendelse, udvalgte fysisk-kemiske egenskaber, EC50, 24h for immobilisering af Daphnia magna og NOEC21d-værdier for reproduktion af Daphnia magna for de undersøgte stoffer. Fysisk-kemiske data for dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat, diquat, chlorpyrifos, pyrazophos, azoxystrobin og bromoxynil fra Tomlin 2003; Data for toksicitetstests med disse stoffer er fra Miljøstyrelsen, 2005. Data for 4-nitrophenol fra Verschueren, 1996; data for 3,5-dinitrophenol fra Toxnet, 2005 og fra US-EPA, 2004.
Kow: Oktanol-vand fordelingkoefficienten; S: Vandopløselighed; KH: Henry’s lov konstant (fordeling mellem vand- og luftfase). - : ingen data. 2.2.1 Organophosphater
Figur 2: Kemisk struktur af organophosphaterne dimethoat, chlorpyrifos og pyrazophos (Tomlin, 2003). Dimethoat, chlorpyrifos og pyrazophos tilhører gruppen organophosphater, der hovedsageligt anvendes som insekticider (Tomlin, 2003). De fungerer som en acethylcholinesterasehæmmer. Acetylcholin er en neurotransmitter, der overfører impulser mellem neuronen og den motoriske endeplade (musklen). Normalt vil acetylcholin frigives til synapsen mellem to celler og efterfølgende bindes til acetylcholinreceptoren i den postsynaptiske membran. Dette får ionkanaler i cellemembranen, som er selektive for Na+ og K+ til at åbne sig og ionerne passerer dernæst den postsynaptiske membran, hvilket fører til et aktionspotentiale og aktivering af musklen. Virkningen af neurotransmitteren og dermed aktiveringen af musklen, ophører ved at acetylcholinesterase hydrolyserer transmitterstoffet. Er enzymet hæmmet vil denne deaktivering ikke ske (Eckert et al. 1996). Et tegn på forgiftning kan derfor ses som overstimulering af nerverne. Pyrazophos anvendes også som fungicid (Tomlin, 2003). I nogle svampearter virker pyrazophos hæmmende på melaninsyntesen (pigment) men pyrazophos kan også forhindre udviklingen af appressoria (parasitiske svampe) (Tomlin, 2003). Appressoria er specielle hyfer i svampen, der ligger sig langs overfladen af de fotosyntetiske celler i værtsorganismen, og derved muliggør, at svampen kan penetrere plantens celler (Raven et al., 1992, Lawrence, E., 1995). I 2003 blev der solgt 30629 kg dimethoat (93% heraf til landbrugsformål) og 529 kg chlorpyrifos. Dimethoat anvendes især i korn, men også i majs, roer, grøntsager, græs og kløver. Normaldoseringen for dimethoat er ca. 300 g aktivstof/ha (Miljøstyrelsen 2004). Det skal bemærkes, at pyrazophos ikke er godkendt til brug i Danmark, samt at chlorpyrifos ikke er godkendt til landbrugs/udendørs anvendelse. 2.2.2 Pyrethroider
Figur 3: Kemisk struktur for esfenvalerat, et pyrethroidinsekticid (Tomlin, 2003). Esfenvalerat er et pyrethroidinsekticid (Tomlin, 2003), der anvendes i de fleste afgrøder, dog især korn. Pyrethroider er syntetiske udgaver af det naturlige insekticid pyrethrin, som findes i chrysantemum (Walker et al., 1996). Pyrethroiderne er neurotoxiner og virker ved at forlænge den tid Na+ kanalerne er åbne i nervecellerne. Normalt foregår åbningen og lukningen af kanalerne på under et millisekund- den tid en impuls passerer på. Bindingen af et pyrethroid bevirker således at hvilepotentialet ikke indtræffer og der genereres derfor adskillige aktionspotentialer frem for et enkelt. Resultatet er hyperaktivitet, krampe, lammelse og til sidst dør organismen (Connell, 1997; Stenersen, 2004). Esfenvalerat er optaget på Miljøstyrelsens nyeste liste over forbudte plantebeskyttelsesmidler ”Forbudslisten” i juli 2001, og må derfor ikke anvendes til udendørsbrug med undtagelse af anvendelse til dypning af rod og halssprøjtning af nåletræer (Miljøstyrelsen, 2004). Tidligere var doseringen ved udendørs anvendelse 5-20 g/ha. I 2003 blev der solgt 107 kg esfenvalerat (Miljøstyrelsen 2004). 2.2.3 Carbamater
Figur 4: Kemisk struktur for pirimicarb, et carbamatinsekticid (Tomlin, 2003). Pirimicarb er et carbamatinsekticid (Tomlin, 2003). Carbamater er acetylcholinesterasehæmmere ligesom organophosphaterne. De bindes derfor også til det samme aktive site, men er forskellige ved, at carbamatgruppen bundet til acetylcholinesterase hydrolyseres meget hurtigere end organophosphatgruppen (carbon-oxygen-phosphor bindingen) (Stenersen, 2004). Hermed vil virkningen af carbamater aftage hurtigere end virkningen af organophosphater. I 2003 blev der solgt i alt 5183 kg pirimicarb. Hovedparten (4665 kg) blev solgt til landbrugsformål, og pirimicarb var det fjerde mest solgte insekticid næst efter dimethoat, cypermethrin og tau-fluvalinat. Pirimicarb finder især anvendelse på korn men også på afgrøder så som roer og ærter. Normaldosering er 125-250 g aktivstof/ha afhængig af afgrødetype (Miljøstyrelsen 2004). 2.2.4 Bipyridyl
Figur 5: Kemisk struktur for diquat (Tomlin, 2003). Diquat er et herbicid, som virker ved at danne et superoxid under fotosyntesen som skader cellemembranen og cytoplamaet (Tomlin, 2003). I alt blev 12236 kg diquat til landbrugsformål i 2003 i Danmark. Ud af 45 solgte herbicider var diquat dibromid det 16. mest solgte i 2003. Herbicidet bruges hovedsageligt til nedvisning af kartofler, men også til græs og kløver. Normaldoseringen er 1496 g aktivstof/ha (i kartofler) (Miljøstyrelsen 2004). 2.2.5 Strobilurin
Figur 6: Kemisk struktur for azoxystrobin (Chemfinder, 2004). Azoxystrobin er et fungicid, der tilhører gruppen strubiluriner (Tomlin, 2003). Azoxystrobin virker ved at hæmme respirationsprocessen i mitochondrier. Mitochondrier er cellens ”energifabrik”, og pesticidet virker ved at hæmme elektrontransporten mellem cytochrome b og cytochrome c1. Når elektrontransporten hæmmes, mister cellen således sin evne til at danne energi og dør (Tomlin, 2003, Stryer, 1995). Azoxystrobin anvendes kun i korn og ærter og i 2003 udgjorde salget af azoxystrobin 35941 kg heraf 34941 kg til landbrugsformål. Fungicidet var således det fjerde mest solgte af 16 fungicider til landbruget. Normaldoseringen er 250 g aktivstof/ha (Miljøstyrelsen 2004). 2.2.6 Halogeneret benzonitril
Figur 7: Kemisk struktur for phenoxyherbicidet bromoxynil (Chemfinder, 2004). Bromoxynil er et herbicid (Tomlin, 2003) og tilhører gruppen af halogenerede benzonitriler. Det hæmmer planters vækst ved at hæmme fotosyntesen. Hæmningen sker ved, at herbicidet bindes til fotosystem II og at elektrontransporten blokeres, hvilket stopper CO2- fikseringen samt produktionen af ATP og NADPH2 (Cornell University, 2004). I alt blev der solgt 64101 kg bromoxynil i 2003. Hele salget var til landbruget, hvor bromoxynil var det 6. mest solgte herbicid. Det anvendes til korn, græs og kløver og normaldoseringen er 400 g aktivstof/ha (Miljøstyrelsen, 2004). 2.2.7 Phenoler (referencestoffer)Som reference stoffer er valgt to phenoler (4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol), som begge er særdeles velundersøgte i dafnietest (US-EPA, 2004), og som jf. Tabel 1 har fysisk-kemiske egenskaber, der gør dem relativt nemme at håndtere i forsøgene (dvs. høj vandopløselighed, moderate Kow-værdier og lav flygtighed).
Figur 8: Kemisk struktur af referencestoffet 4-nitrophenol (Chemfinder, 2004). 4-nitrophenol anvendes som syntesekemikalie i forbindelse med fremstilling farmaceutiske stoffer, insekticider og farvestoffer (Rippen, 2004). Stoffet er velundersøgt i økotoksikologiske forsøg (US-EPA, 2004), og optræder bl.a. i miljøet som et nedbrydningsprodukt af organophosphaterne methyl- og ethylparathion.
Figur 9: Kemisk struktur af referencestoffet 3,5-dichlorophenol (Chemfinder, 2004). 3,5-dichlorophenol anvendes ikke til kommercielle formål, men er påvist som nedbrydningsprodukt af højere chlorphenoler, f.eks. pentachlorphenol (Toxnet, 2005). Stoffet anvendes bl.a. som referencestof i de standardiserede testmetoder med bakterier (ISO 1996) og alger (ISO, 1989b). 2.3 Teststoffernes skæbne i testsystemetVed de udførte test blev anvendt et testsystem bestående af 50-100 ml bægerglas fyldt med 25-50 ml vandigt medium. Testorganismerne var udsat for stofferne i 0,5-6 timer, hvorefter de blev overført til rent medium uden teststof. Under alle forsøg er anvendt nominelle stofkoncentrationer, da det af økonomiske årsager ikke har været muligt at foretage kemiske analyser af de aktuelle koncentrationer under og efter eksponering. I det følgende vil de mulige fjernelses- og fordelingsprocesser blive beskrevet (jf. Figur 10) m.h.t. til relevans for de testede stoffer under de anvendte eksponeringsforhold. Vurderingerne er lavet ud fra de fysisk-kemiske data vist i Tabel 1 og stoffernes kemiske strukturer som fremgår af afsnit 2.2.1.-2.2.7.
Figur 10: Mulige fjernelses- og fordelingsprocesser i det anvendte testsystem 2.3.1 FordelingsprocesserReduktion i teststofkoncentrationer som følge af fordampning anses for usandsynlig, når de lave værdier for Henry’s lov konstant (<10-7 atm×m³×mol-1) tages i betragtning. Chlorpyrifos har som eneste stof en Henry’s lov konstant over 10-7 atm×m³×mol-1 og vil derfor kunne have en langsom fordampningshastighed fra vandig opløsning. Fordampning vil dog også kunne udelukkes for chlorpyrifos ved de korte eksponeringstider (£ 6 timer), der anvendes i de udførte forsøg (statiske forsøg, der udføres under låg). Af de testede stoffer er det kun 3,5-dichlorophenol, pyrazophos, chlorpyrifos og esfenvalerat, som er tilstrækkeligt fedtopløselige til potentielt at kunne biokoncentreres (log Kow > 3). Således vil det også kun være for disse stoffer, at sorption til glasvægge vil kunne betyde en nedsættelse af vandfasekoncentrationen. Ligevægtsberegninger (fugacitetsmodel) fortaget på det aktuelle testsystem for samtlige stoffer viser, at der for chlorpyrifos og esfenvalerat kan være betydelig nedsat vandfasekoncentration som følge af sorption. Hvor store afvigelser, der vil være mellem de nominelle og de aktuelle koncentrationer er vanskeligt at afgøre ved teoretiske overvejelser, og kemiske målinger burde inkluderes til bestemmelse af eksponeringskoncentrationerne. Dette er imidlertid faldet uden for rammerne af nærværende projekt. Dog skal det holdes in mente, at eksponeringen af forsøgsdyrene i disse test er af få timers varighed (0,5-6t), og at dyrene ikke får tilført nogen føde som pesticidet evt. ville kunne absorberes af eller adsorberes til under eksponeringen. Begge disse forhold nedsætter risikoen for stoffjernelse ved sorption. 2.3.2 FjernelsesprocesserEksponeringer foregår i syntetiske medier under anvendelse af milliporevand, og hvor forholdene for mikrobiologisk vækst ikke er optimale. Set i lyset af de korte eksponeringstider udelukkes mikrobiel nedbrydning derfor som fjernelsesproces. Eksponeringerne er udført i mørke, og derfor udelukkes også fotokemiske omdannelse som fjernelselsesproces. Flere af de testede pesticider (organophosphaterne, esfenvalerat, pirimicarb og azoxystrobin) vil, ud fra en vurdering af deres kemiske struktur, kunne undergå en hydrolytisk spaltning ved kontakt med vand. Organophophaterne (dimethoat, chlorpyrifos og pyrazophos) vurderes at være de stoffer, for hvilke hydrolysen er af størst betydning, og der vil teoretisk set kunne ske en nedsættelse af toksiciteten over tid. I det anvendte pH interval (pH 7,0-8,5) er målt halveringstider for hydrolyse på 4-118 dage for dimethoat og 22-35 dage for chlorpyrifos (Toxnet, 2005) og halveringstider i samme størrelsesorden må forventes for pyrazophos. Set i forhold til de aktuelle eksponeringstider (£ 6 timer) vurderes det at være rimeligt, at der ses bort fra hydrolyse som fjernelsesproces i de udførte pulsforsøg. 2.4 Daphnia magna som testorganismeSom forsøgsorganisme benyttes Daphnia magna, der er en hyppig brugt testorganisme i økotoksikologiske forsøg. Dermed er den og dens respons overfor kemiske påvirkning vel beskrevet i litteraturen og sammenligninger er derfor mulige. Dafnier forekommer endvidere på mange lokaliteter, og er ligesom mange andre invertebrater mere stedfaste end fisk, der flytter sig meget og forlader et område hvis der opstår en kritisk periode (Miljøstyrelsen, 1998). Arten er økologisk relevant, da dafnierne lever af at græsse planktonalger og detritus og de er derfor vigtige for stofomsætningen der hvor de lever (søer og damme) (Jespersen & Lützen, 1996). Dafnier formerer sig ved parthenogenese (ukønnet formering), og producerer således kloner af sig selv under gunstige forhold (Jespersen & Lützen, 1996). Herved undgås variationer i forsøgsresultater på grund af genetiske forhold, testene bliver mere reproducerbare og der er mulighed for hurtig opformering. Ved pulseksponering forventes et forsinket toksisk respons, og immobilitet, som er det traditionelt anvendte endpoint i dafnietest, vil være mere anvendeligt end f.eks. dødelighed. Ved anvendelse af Daphnia magna kan såvel sub-letale (immobilisering) som kroniske (reproduktion) endpoints undersøges med samme organisme, og da der findes internationalt standardiserede testprocedurer for begge endpoints muliggøres sammenligninger med allerede eksisterende data. Endelig skal som rent praktiske hensyn nævnes, at dafnier ikke er vanskelige at håndtere, og at selv unge dyr har en god størrelse - de kan ses med det blotte øje. 2.5 Pulseksponeringsforsøg beskrevet i litteraturenMed henblik på at afklare eventuelle overlap mellem den foreslåede metode og eksisterende metoder til påvisning af pulseffekter af pesticider på krebsdyr er gennemført et litteraturstudie, som vil blive beskrevet i det følgende. 2.5.1 Akutte effekterDen anvendte metode er udviklet med udgangspunkt i PE-LET50-metoden beskrevet af Brent & Herricks (1999), hvor dyrene (Daphnia magna) observeres i en post-eksponeringsperiode efter en kort pulslignende eksponering. Der er anvendt de samme præliminære tests (OECD/ISO test), eksponeringsscenarier og post-exposure observationsperioder, men hvor Brent & Herricks (1999) udelukkende fokuserer på akutte effekter (immobilsering), er metoden udvidet til også at omfatte kroniske effekter (reproduktion). I artiklen af Brent & Herricks (1999) er fokus rettet mod regnbetingede udledninger fra byområder, og udover en beskrivelse af test med referencestofferne zink og cadmium belyses effekten af enkeltstoffer ikke. I et andet studie udført af Brent & Herricks (1998) er effekterne af en kortvarig eksponering med zink, cadmium og phenol beskrevet for invertebraterne Ceriodaphnia dubia og Hyalella azteca. I dette studie blev også anvendt posteksponerings-observationer, men igen var fokus på immobilisering og ikke på længerevarende effekter. Som det fremgår er phenol det eneste organiske stof for hvilket, der er publiceret resultater fra posteksponeringsstudierne udført af Brent & Herricks (1998, 1999), og effekten af pesticider er således ikke beskrevet tidligere. 2.5.2 Forsinkede effekterForsinkede effekter af pulseksponeringer af andre organismer og ved andre testmetoder er beskrevet i litteraturen. Wright (1976) så således, at graden af toksicitet kan ændres, hvis der inkluderes en observationsperiode efter eksponering, og stoffer med en høj initiel toksicitet virkede således mindre toksiske, når der blev inkluderet en observationsperiode. For phenol fandt Brent & Herricks (1998), at C. dubia genvandt mobilititeten efter den kortvarige eksponering var ophørt. For myggelaver udsat for permethrin, fenitrothion, carbaryl og carbofuran er et ”recovery” efter kortvarig eksponering således beskrevet af Parsons & Surgeoner (1991), mens der for krebsdyr og fisk udsat for kortvarige eksponeringer af lindan (Abel 1980), permethrin (Abel & Gardener, 1986), chlorpyrifos, endrin, fenvalerat (Jarvinen et al., 1988) og esfenvalerat (Holdway et al, 1993) er fundet forøget mortalitet efter posteksponerings-observationer. 2.5.3 Kroniske effekterBlandt de få studier, der beskæftiger sig med kroniske eller sub-kroniske effekter af pesticider ved pulseksponering af invertebrater, skal nævnes undersøgelser udført af Schulz & Liess (2000) med vårfluelarver udsat for fenvalerat i 1 time. Dyrene blev efter eksponering i laboratoriet overført til udendørs mikrokosmer med strømmende vand, og observationsperioden strakte sig over 240 d. Der blev fundet effekter helt ned til 0,001 mg/l i vandfasen, men selvom mulighederne for ekstrapolation af testresultaterne er gode ved denne metode vurderes metoden dog at være for tids- og arbejdskrævende (der kigges på 3 forskellige endpoints og effekten af sedimenttilsætning), hvis effekter af en række pesticider skal undersøges. Med hensyn til langtidseffekter på dafnier efter pulseksponering med pesticider skal undersøgelserne foretaget af Hosmer et al. (1998), Naddy et al. (2000) og Naddy & Klaine (2001) fremhæves. I disse studier anvendes Daphnia magna til undersøgelse af effekten af pulseksponeringer med pesticider (fenoxycarb og chlorpyrifos). Hosmer et al. (1998) undersøgte effekten af fenoxycarb hos Daphnia magna i en simuleret pulseksponering, hvor stoffets halveringstid blev anvendt til dimensionering af pulsen i et flow-through testsystem. Der blev udført reproduktionsstudier med de eksponerede dafnier, men dette studie anvender ikke egentlige posteksponeringsforsøg. Organismer blev således ikke overført til rent medie efter eksponering, men der skete en gradvis reduktion af fenoxycarb koncentrationen over de 21 dage testen varede. Det skal bemærkes, at Hosmer et al. (1998) fremhæver den udtalte datamangel for kroniske effekter efter pulseksponering, samt at deres undersøgelser viste markant lavere toksicitet af fenoxycarb, når pulseksponeringsforsøgene blev sammenlignet med reproduktionstest udført med kontinuert eksponering. Naddy et al. (2000) gennemførte undersøgelser, hvor Daphnia magna blev udsat for små koncentrationer af chlorpyrifos (<1 mg/l) i pulseksponeringer med varigheder fra 1-72 timer. Såvel akutte som kroniske effekter af chlorpyrifos blev inkluderet. I undersøgelsen blev kun akutte effekter fundet, og der blev ikke observeret forsinkede effekter af chlorpyrifos, og altså heller ikke dokumenteret kroniske effekter af pesticidet. Naddy et al. (2000) fandt ingen effekter af chlorpyrifos ved pulseksponeringer på <12 timers varighed. I artiklen af Naddy & Klaine (2001) fokuseres på effekten af gentagne pulseksponeringer af chlorpyrifos. Der anvendes grundlæggende samme metode, som af Naddy et al. (2000), men der anvendes dafnier, som er 7 dage gamle ved eksponeringen, og kun akutte effekter er beskrevet. Det er nemlig væsentligt at bemærke, at Naddy et al. (2000) fandt markante forskelle i testorganismernes respons afhængigt af dyrenes alder på eksponeringstidspunktet, således var 3-, 7- og 14-dage gamle dyr mere følsomme end de nyfødte unger, når overlevelse blev anvendt som endpoint i en 21-dages test. Det skal dog bemærkes, at disse konklusioner udelukkende bygger på, at der var en større effekt på overlevelsen efter en gentagen puls, som desuden var af højere koncentration end den indledende.
|
