| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Toksiske effekter af pulseksponering af pesticider - akutte og kroniske effekter hos Daphnia magna

3 Materialer og metoder

• 3.1 Kultivering af testorganismer og alge
• 3.2 Anvendte kemikalier og testopløsninger
• 3.3 Validitetskriterier
• 3.4 Akuttest med kontinuert eksponering (ISO test)
• 3.5 Pulseksponering
  • 3.5.1 Valg af stofkoncentrationer
  • 3.5.2 Procedure for pulseksponering - korttidseffekter
  • 3.5.3 Fodring under pulstests.
  • 3.5.4 Gentagne pulse og pulseksponering af 3 dage gamle dafnier
  • 3.5.5 Alder og følsomhed
  • 3.5.6 Procedure for pulseksponering - langtidseffekter
• 3.6 Databehandling

I det følgende beskrives de materialer og metoder, der er anvendt i projektet. Som en del af projektet er udarbejdet en egentlig testprotokol, som har en større detaljeringsgrad end det nedenfor beskrevne. Testprotokollen findes i Bilag 1.

3.1 Kultivering af testorganismer og alge

Som forsøgsorganisme benyttes Daphnia magna, indsamlet i Langedammen ved Birkerød i 1978 og dyrket i laboratoriet siden. Dafnierne holdes i akvarier med kunstigt fremstillet ferskvand (M7-medie, se Bilag 1), der fremstilles i laboratoriet. Dafniestamkulturen dyrkes i klimarum ved en temperatur på 20°C ± 2°C og en 12:12 timers lys/mørke periode (4-6 μE·m^-2·s^-1). Kulturerne holdes i 4,2 liters akvarieglas eller bægerglas med et volumen på 800 ml. Akvarierne fyldes med 1,6 l M7-medie og pyrexglassene fyldes med 800 ml M7 medie, og der tilsættes maks. 30 hunner pr. akvarie og maks. 20 til pyrexglassene. Akvarieglassene overdækkes med plastiklåg, så der ikke kan komme støv og lignede ned i glassene. Tilsættes der flere hunner, kan konkurrencen mellem dyrene blive for stor, og produktionen af juvenile minimeret. Dyrene får rent medie 2 gange ugentligt med 3-4 dages mellemrum. Det nye medie består af 50% nyfremstillet M7-medie og 50% af det M7-medie, dyrene har opholdt sig i i den forgange periode. Moderdyrene overføres til det nye medie med et nylonfilter. Der laves løbende nye dafniekulturer så produktionen af juvenile holdes på et optimalt niveau (ca. 10-20 unger pr. moderdyr pr. 2-3 dag). Moderdyrene udskiftes når de er ca. 8 uger gamle.

Dafnierne får føde i form af grønalgen Pseudokirchneriella subcapitata (tidligere kaldet Selenastrum capricornutum). Algekulturen stammer fra kulturindsamlingen fra Norsk Institut for Vandundersøgelser (NIVA Oslo, Norge). Algekulturen dyrkes til en tæthed på 2-4×10⁶ celler/ml og tilføres dafnierne 3 gange dagligt v.h.a. et pumpesystem. Selve algekulturen befinder sig på en magnetomrører, der sørger for, at algerne forbliver i en homogen suspension. Mængden af føde, der tilføres svarer til 0,1-0,2 mg C /dyr/dag (C = carbon). Hvis det vurderes, at være nødvendigt, f.eks. hvis der ikke produceres tilstrækkeligt med unger, kan der tilsættes en smule tørgær, som ekstra foder. Tørgæret opløses i en smule medie inden det kommes i akvariet. Fremstilling af foder fremgår af Bilag 1. Algekulturen holdes i pyrexflasker ved en temperatur på 4°C, indtil den skal anvendes til foder. Flasken skal rystes før brug, da algen bundfælder under opbevaringen.

Dafnier (Daphnia magna), der anvendes i forsøgene, er < 24 timer gamle. Dette sikres ved at fjerne alle unger fra moderdyrene senest 24 timer inden forsøgene sættes i gang (jf. ISO 6341, 1989a). Efter 24 timer vil alle unger i glas med moderdyr således være <24 timer gamle, og disse indfanges og anvendes i de videre forsøg.

3.2 Anvendte kemikalier og testopløsninger

De anvendte referencestoffer og pesticider var alle af analysekvalitet (renhed 98-99,9%) og blev indkøbt fra Sigma-Aldrich A/S, København. Alle øvrige anvendte kemikalier til medier m.v. var ligeledes af analysekvalitet og blev indkøbt fra Merck, København. Gennem hele studiet blev anvendt destilleret vand, som blev ledt gennem et milliporeanlæg inden anvendelse. Stamopløsninger blev fremstillet ved at opløse den ønskede mængde af pesticid direkte i M7-medie. I de tilfælde, hvor et pesticid ikke kunne opløses direkte i M7, blev opløsningsmidlet dimethylsulfoxid (DMSO) anvendt som ”carrier”. En stamopløsning bestående af 10 ml DMSO tilsat pesticid blev fremstillet og ud fra denne blev en endelig stamopløsning fremstillet i M7-medie. Denne stamopløsning indeholdt maksimalt 0,1‰ (v/v) DMSO.

3.3 Validitetskriterier

Der blev målt ilt (Orion elektrode) og pH (PHM 210 standard pH-meter) i testopløsningerne (højeste koncentration) og i kontrollen under alle forsøg. For de kroniske tests blev der desuden foretaget målinger ved hvert medieskift. I følge ISO (1989a) kræves en iltmængde på = 2 mg/l og en pH på 7,8 ± 0,2 under akuttestene. Kravet i OECD guidelinen for kroniske test er en iltkoncentration på 3 mg/l og en pH mellem 6-9, der desuden ikke varierer mere end 1,5 enheder (OECD, 1998). I alle test blev ilt-kravet overholdt (se Bilag 2), idet der blev gennemført test med 7,2-9,8 mg/l ilt. pH-værdien i de udførte test var 7,2-8,9 og varierede ikke mere end 1,5 pH-enhed i hver test.

I overensstemmelse med ISO standarden (ISO, 1989a) blev kaliumdikromat (K₂Cr₂O₇) anvendt som referencestof gennem hele projektperioden. I alle tilfælde holdt de funde IC₅₀-værdier sig inden for det af ISO beskrevne interval (IC_{50, 24 t} = 1,47 ± 0,57).

3.4 Akuttest med kontinuert eksponering (ISO test)

Formålet med de udførte ISO-test er at bestemme effektkoncentrationer (EC-værdier) for 24 timer og  48 timer ved observation af ekponerede dyrs mobilitet. Disse værdier skal dernæst anvendes til design af pulseksponeringstest. Alle akutte tests blev udført i henhold til ISO-standarden for dafnietest (ISO, 1989a). For at finde det koncentrationsinterval, hvor et respons fra dyrene på de undersøgte pesticider kan forventes, blev der udført ”range finding test” for alle stoffer. Under disse test blev brugt én kontrolgruppe á fem individer og for hver testkoncentration blev der eksponeret én gruppe af fem individer.

Ved de definitive test blev anvendt 4 replikater pr. koncentration og 6 replikater i kontrolgruppen. De ekstra replikater i kontrolgrupperne er tilføjet udelukkende med den hensigt at styrke data, da samtlige resultater relateres til kontrolgruppernes respons. Hver replikat bestod af 25 ml testopløsning (M7 tilsat teststof/pesticid) og 5 juvenile Daphnia magna (<24 t). Testene forløb i mørke og dyrene blev eksponeret i 48 timer. Der blev ikke skiftet opløsning i løbet af de 48 timer. Testkoncentrationer fremgår af  Tabel 2.Under eksponeringen blev dyrene ikke fodret. I forhold til ISO-testen er antallet af observationstider øget, således at dyrenes mobilitet og dødelighed observeres efter 0, 2, 4, 6, 24 og 48 timers eksponering. Registreringen foregik ved observationer på lysbord, og om nødvendigt v.h.a stereolup. Nedenstående definitioner af immobilitet og dødelighed er anvendt ved alle udførte forsøg, d.v.s. såvel akuttest som pulseksponeringsforsøg:

Immobilitet:    Dafnier, som ikke kan opretholde deres position i vandsøjlen (svømme) selv efter en forsigtig stimulering (15 sek.), regnes for immobile. Dafnierne kan have krampeagtige bevægelser. Døde dafnier vil indgå i det samlede antal immobile dafnier, men der skelnes mellem døde og immobile dyr ved observationerne.

Dødelighed:    Dafnier, der ikke har nogen form for bevægelse, som f.eks. bevægelse af antenner, selv 15 sekunder efter stimuli, regnes for døde (Naddy et al., 2000, OECD, 1998).

I praksis blev dette overført til, at mobile dyr skal svømme i løbet af de 15 sekunder de observeres men ikke nødvendigvis i alle de 15 sekunder. Dette skyldes, at der ofte blev observeret dafnier, der ikke svømmer i en kort tidsperiode (opholder sig typisk i bunden af glassene) for så pludselig at svømme livligt rundt.

Tabel 2: Koncentrationer benyttet under akuttest med Daphnia magna. Ved alle test er inkluderet en kontrolgruppe, der ikke eksponeres for teststof.

*DMSO anvendt som bærestof (max. 0,1‰ (v/v)). Ved disse test er yderligere inkluderet kontrolgruppe med 0,1 ‰ (v/v) DMSO.

3.5 Pulseksponering

3.5.1 Valg af stofkoncentrationer

De anvendte eksponeringskoncentrationer i pulstestene blev udvalgt på baggrund af de indledende akutte tests. Værdierne blev valgt med udgangspunkt i de beregnede IC_{90, 24t}-værdier, men der blev ligeledes taget hensyn til dyrenes tilstand efter 6 timer under akuttestene. I de tilfælde, hvor der kunne observeres en respons, blev der set på om det var i form af dødelighed eller immobilitet. Koncentrationer, hvor immobilisering indtrådte, blev foretrukket, da muligheden for at observere et recovery ellers ikke ville være til stede. Disse kriterier for udvælgelse af koncentrationer medførte i flere tilfælde, at kun et ganske snævert koncentrationsinterval blev aktuelt at undersøge i pulstestene.

3.5.2 Procedure for pulseksponering – korttidseffekter

Fremgangsmåden for pulseksponeringen er vist i Figur 11. Dyrene blev eksponeret i grupper af 20 individer (30 i kontrolgruppen) og efter endt eksponering blev de indfanget og overført med engangspipette til et skyllekar. Dyrene blev indfanget i skyllekarret v.h.a. et fintmasket net, og dyrene blev delt i 4 grupper pr. eksponeringstid og 6 grupper for kontrolgruppen. De ekstra replikater i kontrolgrupperne er også her tilføjet med henblik på at styrke data, da samtlige resultater relateres til kontrolgruppernes respons. Hver replikat bestod således af 5 juvenile Daphnia magna (<24 t). Kontrolgruppen (30 dyr) blev behandlet på tilsvarende måde som gruppen, der fik en puls af 0,5 time, da det blev antaget, at der vil være størst stress, når dyrene håndteres gentagende gange med korte tidsintervaller (dvs. ”worst case” for kontrollerne). Der blev ikke inkluderet en DMSO kontrol under pulsforsøgene, da der ikke blev registreret en effekt (døde/immobile) i DMSO kontrollerne under de akutte tests.

Antallet af immobile og døde dyr blev optalt 0 timer, 24 timer og 48 timer efter pulsens ophør. I posteksponeringsperioden fik dyrene føde i form af algen Pseudokirchneriella subcapitata. Fødemængden svarede til 0,1-0,2 mg C/dag, hvilket er den anbefalede mængde føde i ISO (1989a) og blev tilført til tiden t = 0 timer (pulsophør).

Figur 11: Fremgangsmåde for pulseksponering af dafnier. For hver testet koncentration inddeles dafnierne i grupper afhængig af eksponeringstid. Efter endt eksponering overføres alle dyr til et kar med rent M7 medie (skylning) og dernæst deles de 20 dyr pr. eksponeringstid i 4 replikater á 5 dyr og overføres til glas med rent M7-medie tilsat alge (observation).

3.5.3 Fodring under pulstests.

Der blev udført forsøg til bestemmelse af fødens invirkning på mobiliteten hos Daphnia magna, der havde været udsat for en puls af et pesticid (pirimicarb 100 μg/l og dimethoat 30,0 mg/l). Forsøget blev udført som de øvrige pulseksponeringsforsøg, d.v.s samme eksponeringmåde og samme foder og fodermængde (Pseudokirchneriella subcapitata: 0,1-0,2 mg C/dafnie/dag), med undtagelse af at én gruppe i dette forsøg ikke blev fodret efter endt pulseksponering. Den %-vise ændring i mobiliteten (immobile/døde) kunne således blive registreret, sammenlignet for grupperne og relateret til fodringsstatus. Under forsøget med dimethoat blev dyrene eksponeret i en fælles beholder og derefter tilfældigt indsamlet og fordelt i observationsglassene. Under forsøget med pirimicarb blev dyrene delt i to grupper allerede inden eksponeringen for pesticidet.

3.5.4 Gentagne pulse og pulseksponering af 3 dage gamle dafnier

Princippet i dette forsøg svarede til proceduren beskrevet for pulseksponering. Den eneste forskel var, at dyrene i de gentagne pulstest blev eksponeret for to pulse. Efter observationsperiodens ophør, d.v.s. 48 timer efter den første puls, blev dyrene således udsat for endnu en puls af samme koncentration og varighed som den første puls. Forsøgene blev udført med stofferne pyrazophos (2,50 μg/l og 5,00 μg/l), dimethoat (10,0 mg/l og 20,0 mg/l), pirimicarb (40,0μg/l og 70,0μg/l) samt esfenvalerat (10,0 μg/l). I forbindelse med disse forsøg med gentagne pulse, blev der også udført et forsøg med 3 dage gamle dafnier, der fik en enkelt pulseksponering, for at se om der er en aldersafhængig forskel i responset. Forsøgsprincippet er som beskrevet for pulseksponsering af 24 timer gamle dafnier.

3.5.5 Alder og følsomhed

ISO standarden (ISO 1989a), der benyttes til bestemmelsen af immobiliteten hos Daphnia magna efter kontinuert eksponering for et givent stof, benytter organismer, der er under end et døgn gamle (<24t). Imidlertid er forskellige aldersgruppers varierende følsomhed overfor pulse af pesticider blevet undersøgt og beskrevet i litteraturen (Naddy et al., 2000). På baggrund heraf blev der igangsat en indledende undersøgelse til bestemmelse af følsomheden hos 4 forskellige aldersgrupper hos dafnier: <24t, 3d, 5d og 7d. Dyrene blev pulseksponeret på samme måde som beskrevet i afsnit 3.5.2.

3.5.6 Procedure for pulseksponering – langtidseffekter

Pulseksponering af <24 t gamle dafnier foregik som beskrevet ovenfor, dog anvendes kun 10 dyr pr. eksponeringstid og i kontrolgruppen. Gruppen af dyr, der skal have en puls af 6 timers varighed, eksponeres som den første og 2 timer senere eksponeres gruppen, der skal have en puls af 4 timers varighed o.s.v. indtil alle grupper er blevet eksponeret. Ved overførsel fra skyllekarret fordeles dyrene i 10 glas pr. eksponeringstid (eller kontrol), d.v.s. at dyrene går enkeltvis i hver deres 50 ml bægerglas i hele posteksponeringsperioden. Dyrene i kontrolgrupperne eksponeres for rent M7-medie på samme måde som dyrene, der eksponeres for et kemikalie. D.v.s. de bliver også overført til et nyt medie og ”skyllet”. På denne måde sikres det, at variationer ikke skyldes forskelle i håndteringen af organismerne (Naddy & Klaine, 2001).

Reproduktionen hos Daphnia magna følges efter en pulseksponering (0,5t, 1t; 2t; 4t; og 6t) og 21 dage frem. I posteksponeringsperioden frem til de 21 dage får dyrene føde tilsat i form af algekulturen Selenastrum capricornutum. Mængden af føde svarer til ca 0,1 mg C/dag den første uge og ca. 0,2 mg C/dag de sidste to uger og tilsættes hver anden dag.

Følgende parametre blev registreret:

• Tiden før første reproduktion.
• Antallet af levendefødte unger pr. hun.
• Afvigelser fra ”normal” som f.eks. tilstedeværelsen af hanner noteres ligeledes.
• Gennemsnitlig længde af overlevende moderdyr.
• Gennemsnitlig tørvægt af overlevende moderdyr.

Dagen, hvor de første unger observeres noteres, og juvenile fjernes derefter hver anden dag v.h.a. en pipette. Antallet registreres ved hver oprensning. Moderdyrenes længde på dag 21 er opmålt vha. af et kamera (Leica M26) tilsluttet et mikroskop (Olympus BH-2type). Der blev taget et billede af hver dafnie efter testens afslutning og dafnierne blev opmålt v.h.a. programmet AxioVision LE Rel. 4.1.

Vægten af dyrene blev bestemt ved at tage alle de overlevende dyr i en gruppe og veje dem samlet. Filterpapir blev tørret i alubakker ved 105 ºC i en time og overført til nedkøling i en eksikator med silikat inden de blev vejet. Dernæst blev de overlevende dafnier i én gruppe overført til et stykke tørret filterpapir, tørret ved 105 ºC i 1 døgn overført til eksikator og vejet (Dansk Standardiseringsråd, 1980). Dafnierne blev vejet som en samlet gruppe for at være sikker på, at der var dyr nok til, at vejningen kunne gennemføres med tilstrækkelig nøjagtighed. Vægten af dafnierne i en gruppe kunne herved bestemmes som differencen mellem papirets vægt og vægten af dafnier og papir.

Ved opstilling af langtidstestene samt ved vurdering af resultaterne herfra er anbefalingerne i OECD’s standard reproduktionstest med Daphnia magna (OECD, 1998) blevet fulgt, d.v.s. de udførte test har overholdt krav om max. 20 % døde moderdyr blandt kontroldyr, krav om min. 60 unger pr. moderdyr i kontrolgruppen, en pH-værdi mellem 6 og 9 (som ikke varierer mere end 1,5 enheder) og et O₂-niveau over 3 mg/l. Desuden er der lavet visse modifikationer, da standard reproduktionstesten reelt er designet som en forlænget akuttest, hvor dyrene går i en fast stofkoncentration i modsætning til pulstesten, hvor dyrene eksponeres en given tidsperiode, hvorefter de igen kommer over i rent medie. I OECD guidelines anbefales det, at mediet med kemikalie skiftes tre gange ugentligt for at sikre, at niveauet af kemikalie holdes på et fast niveau. Da dyrene i pulstesten for langtidseffekter kommer over i et rent medie uden kemikalie efter få timer er dette ikke nødvendigt, og mediet skiftes derfor to gange ugentligt på samme måde som stamkulturen med moderdyr. I OECD (1998) er der krav om mindst 10 testdyr pr. koncentration. Dette er overført til 10 testdyr pr. eksponeringstid ved fastholdt koncentration.

3.6 Databehandling

For alle udførte forsøg gælder, at det samlede antal forsøgsorganismer i samme kontrolgruppe eller i samme eksponeringsgruppe (koncentration (ISO-test) eller eksponeringstid (pulstest)) blev slået sammen til én gruppe ved databehandlingen (f.eks. betragtes 4 replikater á 5 dyr udsat for samme eksponering ikke som enkelt-replikater, men som én gruppe på 20 dyr). Hvis der var medtaget to forskellige kontrolgrupper, i tilfælde hvor opløsningsmidlet DMSO blev benyttet, blev disse to grupper ikke slået sammen men behandlet hver for sig.

Koncentrations-respons kurver for ISO-test estimeres ved hjælp af programmet ToxCalc ver. 5.0. Her udføres Shapiro-Wilk’s test for normalfordeling, test for varianshomogenitet og endelig maximum-likelihood estimation af koncentrations-respons kurven v.h.a. logit-modellen. Ud fra dosis-respons kurven beregner programmet IC_x-værdier (immobiliseringskoncentrationer med ”x” fra 1-99% effekt) med tilhørende 95%’s konfidensintervaller.

Resultater for ISO-test med kontinuert eksponering og udvidede observationsintervaller er desuden analyseret med programmet DEBtox ver. 1.1 udviklet af Kooijman & Bedaux (1996). Programmet er designet til at analysere data fra standardiserede toksicitetstest med hyppige observationer. Modellen bag programmet bygger på teorien om ”dynamic energy budget” (DEB), og kort fortalt er det med DEBtox muligt at analysere de tredimensionelle effektflader, der fremkommer, når antallet af immobile dyr afbildes mod eksponeringstid og teststofkoncentration (for en fyldestgørende gennemgang af DEB henvises til Kooijman & Bedaux, 1996). I nærværende sammenhæng er DEBtox anvendt til beregning af NEC-værdier (no effect concentration). Fordelen ved at anvende NEC (fremfor f.eks. NOEC eller IC_x-værdier) er, at denne parameter er uafhængig af eksponeringstiden (Kooijman & Bedaux, 1996).

Under pulstestene registreres det samlede antal immobile (immobile og døde) til tiderne t = 0, 24 og 48 timer efter eksponeringens ophør. Ud fra registreringerne bestemmes den (ikke-lineære) kurve, der beskriver dyrenes respons som funktion af eksponeringstiden. Denne eksponeringstids-respons kurve estimeres ved brug af logit funktionen i programmet ToxCalc ver. 5.0, som beskrevet ovenfor. Herudfra kan immobiliseringstider (IT_x-værdier) beregnes, hvor det som oftest er de eksponeringstider, som giver 50%’s effekt (IT₅₀), der anvendes om endpoint for testen. Da der er tale om posteksponeringsforsøg, hvor tiden (t) fra eksponeringens ophør er vigtigt for fortolkningen af resultatet anvendes betegnelsen PE_t-IT₅₀ som resultat af testene i overensstemmelse med anbefalinger af Brent & Herricks (1999). PE_t-IT₅₀ udtrykker pulslængden, der hæmmer mobiliteten af 50% af forsøgdyrene t timer efter eksponeringens ophør. PE_t-IT₅₀ er således udtrykt i timer, og da der i de udførte forsøg er foretaget posteksponeringsobservationer 0, 24 og 48 timer efter eksponeringens ophør vil PE_0t-IT₅₀, PE_24t-IT₅₀ og PE_48t-IT₅₀ blive anvendt i det følgende.

Sker der et fald i de beregnede PE_t-IT₅₀ med tiden efter eksponering (dvs. PE_0t-IT₅₀>PE_24t-IT₅₀>PE_48t-IT₅₀) beskrives dette i det følgende som en forsinket negativ effekt, idet dyrenes tilstand forværres i posteksponeringsperioden. Observeres derimod en stigning i de beregnede PE_t-IT₅₀ med tiden efter eksponering (dvs. PE_0t-IT₅₀<PE_24t-IT₅₀<PE_48t-IT₅₀) betegnes dette som en restitution eller recovery, idet dyrenes mobilitet forbedres i tiden efter eksponeringens ophør.

Til vurdering af data opnået ved test for kroniske effekter af pulseksponering blev programmet S-Plus 2000 anvendt til beskrivelse af en mixed-effect model (også kaldet ”repeated measures” analyser). Denne model anvendes ud fra den betragtning, at observationerne i datasættet ikke er uafhængige, da det er sandsynligt, at der er en sammenhæng mellem antal unger produceret efter 14 dage og antal unger produceret efter 21 dage af det samme moderdyr. Ved den anvendte model undersøges om, der er signifikante forskelle i antallet af afkom pr. moderdyr (Y_ij) som funktion af eksponeringstid og dyrenes kropslængde. Den anvendte model kan kort beskrives som:

- hvor β₁ og β₂ angiver en evt. effekt af hhv. eksponeringstid og dyrets længde, mens γ_j angiver dyr nr. j. Endelig angiver ε_ij afvigelsen mellem model og observation.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 August 2006, © Miljøstyrelsen.