| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Toksiske effekter af pulseksponering af pesticider - akutte og kroniske effekter hos Daphnia magna

4 Resultater

• 4.1 Akuttest med kontinuert eksponering (ISO test)
• 4.2 Betydningen af fodring i posteksponeringsperioden
• 4.3 Pulstest
• 4.4 Opsummering af forsinkede effekter af pulseksponering
• 4.5 Gentagne pulse
• 4.6 Pulseksponering - aldersvariation i følsomhed
• 4.7 Langtidseffekter af pulseksponering
  • 4.7.1 Antal afkom efter pulseksponering
  • 4.7.2 Antal dage før første reproduktion
  • 4.7.3 Kropslængde og vægt efter pulseksponering
  • 4.7.4 Antal unger, eksponeringstid og kropslængde

4.1 Akuttest med kontinuert eksponering (ISO test)

I Figur 12 er vist et eksempel på de koncentration-responskurver, der er opnået ved akuttest med kontinuert eksponering. Der er tale om en standard ISO-test, men med udvidede observationer, således at dyrenes mobilitet blev registreret efter 2, 4, 6, 24 og 48 timers eksponering. Samtlige koncentrations-responskurver er vist i Bilag 3. Som forventet blev der observeret en klar forøgelse af antallet af immobile dyr jo længere tid dyrene var udsat for stofferne. For esfenvalerat sås effekter allerede efter 2 timer eksponering (Fig. 12), men som det fremgår af Bilag 3 var dette ikke tilfældet for alle de testede pesticider.

Figur 12: Koncentration-responskurve for immobilisering af Daphnia magna udsat for esfenvalerat i ISO test med kontinuert eksponering.

Under akuttesten, blev der observeret forskelle i bevægelsesadfærden mellem de mobile dyr i de eksponerede grupper og de mobile dyr i kontrollen. Dyrene, der blev eksponeret, var langsommere i deres bevægelser eller svømmede mere rykvist end kontrolgruppens dyr. Under testen med esfenvalerat blev det således observeret, at eksponerede dyr bevægede sig langsommere, og jo højere koncentrationen blev, jo mere krampeagtige blev dyrenes bevægelser. Kontrolgruppens dyr var i stand til at svømme unden stimulering, hvorimod nogle af de eksponerede gruppper først svømmede efter en blid stimulering

I Tabel 3 er vist de estimerede immobiliseringskoncentrationer (IC-værdier) for alle stoffer efter henholdsvis 24 og 48 timers eksponering. I alle tilfælde ses det, at koncentrationen, der skal til for at immobilisere henholdsvis 10, 50 og 90% af organismerne, falder fra tiden 24 timer og til tiden 48 timer. Disse værdier samt observerede kurveforløb under de første 6 timers eksponering dannede grundlag for udvælgelse af testkoncentrationer i pulstestene. I Tabel 3 er også vist de estimerede værdier for nul-effekt koncentrationen (NEC), og det er værd at bemærke, at der for alle stoffer ses en god overensstemmelse mellem NEC og IC_{10, 48t}.

Tabel 3: Estimerede immobiliseringskoncentrationer (IC) med tilhørende 95% konfidensintervaller efter 24 timers og 48 timers kontinuert eksponering. Nul-effekt koncentrationer (NEC) er estimeret ud fra DEBtox ver. 1.1 (Kooijman & Bedaux, 1996)

a) 100% hæmning observeret for alle koncentrationer. Angivne værdi er den lavest testede koncentration.

b) Langsom kinetik; Enhed: mg·h/l

c) Ikke muligt at beregne vha. DEBtox

4.2 Betydningen af fodring i posteksponeringsperioden

Tidligere undersøgelser har vist, at fodring af dafnier både kan reducere toksisiteten signifikant (Buhl et al., 1993), men også øge den (Naddy & Klaine, 2001). I ISO-standarden (1989a) udføres akut-testene uden tilsætning af føde til mediet i de 48 timer dyrene eksponeres. Begrundelsen er, at tilsætning af føde (alger) vil kunne reducere mængden af stof dyrene reelt eksponeres for. Da dyrene under pulstesten kommer over i rent vand er der dog ikke risiko for en reduktion i stofkoncentrationen p.g.a. adsorption til føden. I dafniernes naturlige miljø vil der desuden være føde til stede. For at undersøge om dafniernes fodertilstand har en betydning for dyrenes recovery, blev der udført to forsøg. Ét med pirimicarb (100 μg/l) og ét med dimethoat (30 mg/l). Resultaterne for pirimicarb fremgår af Tabel 4.

Tabel 4 viser, at der er 8% immobile dyr i den ufodrede kontrolgruppe. Der blev observeret en visuel forskel i størrelsen blandt kontroldyrene. Fodrede dyr var større end ikke fodrede (kontrol) Ligeledes havde ikke fodrede dyr en større tendens til at opholde sig ved bunden frem for at svømme rundt i vandsøjlen. Blandt eksponerde dyr ses der 100% immobilitet uafhængig af eksponeringstid, efter endt pulseksponering.

Tabel 4: Andel immobile dafnier (i procent) hhv. fodrede og ikke-fodrede efter pulseksponering med pirimicarb (100 μg/l).

Fodrede grupper genvinder i større grad deres mobilitet sammenlignet med ikke fodrede. Der er således kun 22% og 24% immobile dyr efter 24 timer i grupper, der har fået en eksponering på henholdsvis 6 og 8 timer, og som får foder, sammenlignet med 44% og 61% immobile i ikke fodrede grupper, der har fået en puls af samme varighed. Efter 48 timer er tallet faldet til 8% i alle fodrede grupper, hvor der stadig er henholdsvis 34% og 33% immobile i ikke fodrede grupper.

Forsøget blev gentaget med en fastholdt koncentration af dimethoat (30 mg/l) og pulsvarigheder på 3, 4 og 6 timer. Ved disse forsøg blev der ikke set nogen effekt af fodring.

På baggrund af forsøgene udført med pirimicarb blev det besluttet at fodre dyrene umiddelbart efter overførslen til rent medie. Hermed opnås også den fordel, at alle gennemførte test har samme udgangspunkt, idet fodring er en nødvendighed i de efterfølgende test med gentagne pulse og med observation over en 21 dages periode.

4.3 Pulstest

Pulseksponeringer af Daphnia magna blev udført for alle teststoffer, og i Figur 13-20 er ændringen i mobiliteten illustreret fra eksponeringen stopper (t = 0) og til observeringsperioden ophører (t = 48). Disse observationer er anvendt til estimation af eksponeringstid-responskurver, og ud fra disse er PE_0t -IT₅₀, PE_24t-IT₅₀ og PE_48t-IT₅₀ værdier beregnet og vist i Tabel 5-8. Alle stoffer er testet i flere koncentrationer, men for overskuelighedens skyld vil der i det følgende kun blive vist resultater for udvalgte koncentrationer for hvert enkelt stof. Data og estimerede tid-responskurver for samtlige test fremgår af Bilag 4.

Tabel 5: PE_t-IT₅₀- værdier for dimethoat, pirimicarb, chlorpyrifos og esfenvalerat med til hørende 95% konfidensintervaller.

For dimethoat og pirimicarb blev det observeret, at testorganismerne genvinder mobiliteten inden for 24 timer efter overførsel til rent medie. Dette er også afspejlet i de stigende PE_t-IT₅₀-værdier (PE_24t-IT₅₀ > PE_0t-IT₅₀) (Tabel 5). Der er ikke markante forskelle mellem PE_24t-IT₅₀ og PE_48t-IT₅₀, og dyrenes tilstand forbedres således ikke målbart ved længere ophold i rent medie. Det skal også bemærkes, at de beregnede PE_t-IT₅₀-værdier, som forventet, falder med stigende eksponeringskoncentration, d.v.s. at den pulsvarighed, der skal til for at hæmme mobiliteten af 50% af dyrene, forkortes når koncentrationen øges (se Bilag 4).

PE_t-IT₅₀-værdierne (Tabel 5) afspejler ligeledes, at dafnier eksponeret for pirimicarb genvinder deres mobilitet i højere grad end dafnier, der er blevet eksponeret for dimethoat, selv om der er en reversibel effekt på mobiliteten efter eksponeringen for både pirimicarb og dimethoat. Effekten af pulseksponering af Daphnia magna med dimethoat og pirimicarb er indgående beskrevet i artiklen af Andersen et al. (2005).

For en illustration af effekterne af dimethoat og pirimicarb, henvises til Figur 21 og 22, hvor øverste række i begge figurer viser effekterne af en enkelt eksponering med de to pesticider.

Figur 13: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 3 μg/l chlorpyrifos. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

For dyr udsat for chlorpyrifos i pulstest var der umiddelbart efter overførslen til rent medie (0 timer) kun påvirkning af få dyr ved de længste eksponeringstider (4-6 timer (Figur 13) og ingen påvirkning ved de øvrige eksponeringstider. 24 timer efter eksponeringens ophør steg andelen af immobile og døde dyr markant i grupper udsat for pulsvarigheder af 4-6 timer. Den største effekt blev set efter eksponeringen for 3 μg/l, dog var det øgede respons efter 24 og 48 timer også tydelig ved 2,5 μg/l (Bilag 4.2.1). Som vist i Tabel 5 faldt PE_t-IT₅₀-værdierne fra tiden t = 0 timer til tiden t = 24, og dyrenes tilstand forværredes således efter eksponeringens ophør. Der er ikke umiddelbart nogen forskel i de beregnede værdier fra 24 timer til 48 timer, men det er værd at bemærke, at dødeligheden steg i tiden fra 24 timer til 48 timer efter endt eksponering.

Figur 14: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 20 μg/l esfenvalerat. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

Pulsforsøget med esfenvalerat (Figur 14 og Bilag 4.2.2) viste en markant effekt på mobiliteten efter endt eksponering. Således var henholdsvis 95% og 100% af dafnierne immobile i grupper, der havde modtaget en puls af 20 μg/l og 4-6 timers varighed og 100% af dafnierne var immobile efter en puls af 30,0 μg/l og 4-6 timers varighed. Selv i grupper, der modtog pulse af 1-2 timers varighed 25-75% af dyrene var immobile). Efter 24 timer genvandt nogle af dyrene mobiliteten, som også illustreres af de stigende PE_t-IT₅₀-værdier (Tabel 5) fra 0 timer til 24 timer efter eksponering. Fra 24 timer og til 48 timer er der et lille fald i PE_t-IT₅₀-værdierne, men som vist i Figur 14 er der grundlag for at udtale sig om en egentlig forværing i dyrenes tilstand i dette tidsrum.

Tabel 6: PE_t-IT₅₀- værdier for pyrazophos og azoxystrobin med tilhørende 95% konfidensintervaller.

a) Kan ikke estimeres, da færre end to partielle responser. Samtlige dyr udsat for 4- og 6-timers pulse var immobile.

Pyrazophos blev testet i fem koncentrationer, og i Tabel 6 er vist resultater for tre af disse, mens der for resultater af de øvrige henvises til Bilag 4.2.3. Effekten af eksponering for pyrazophos blev generelt set i form af immobilisering og ved øgede koncentrationer steg andelen af immobile dyr (Figur 15). Således blev der observeret fuld respons (100% immobilisering) ved koncentrationer ≥ 5 μg/ efter pulseksponeringer af 6 timers varighed. Grupper, der blev eksponeret for koncentrationer mellem 10-20 μg/l, viste ligeledes udprægede forsinkede effekter i form af både immobilisering og dødelighed efter eksponeringen for kortere pulsvarigheder under (2-4 timer), selv om ingen eller kun ringe effekt kunne konstateres efter pulsophør d.v.s til tiden t = 0 timer (jf. Figur 15).

Figur 15: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 7,5-20 μg/l pyrazophos. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

For forsøgene med 10 μg/l og 20 μg/l pyrazophos er ses et fald i PE_t-IT₅₀-værdierne fra tiden t = 0 timer og til tiden t = 24 timer (Tabel 6), men yderligere ophold i rent medie overordnet set ikke ændrer på dyrenes mobilitet. Det skal bemærkes, at stigningen i koncentration fra 10 μg/l til 20 μg/l resulterer i lavere PE_t-IT₅₀-værdier – altså er det, som forventeligt, kun korterevarende pulse dyrene kan modstå, hvis koncentrationen øges.

Figur 16: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 12,5 μg/l azoxystrobin. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

Pulseksponering med azoxystrobin blev udført med koncentrationer i intervallet 10,5-12,5 μg/l. Resultatet for 12,5 μg/l fremgår af Tabel 6 og Figur 16, og resultaterne for de øvrige koncentrationer fremgår af Bilag 4.1.6 og 4.2.4. Til trods for at det ikke var muligt at estimere PE_t-IT₅₀-værdier (Tabel 6), viser resultaterne i Figur 16, at der er en tydelig effekt af eksponeringen for azoxystrobin hovedsageligt i form af dødelighed. Således medførte pulseksponeringer på 4-6 timers varighed, at ca. 25% af dyrene var døde ved overførsel til rent medie (0 timer).

Tabel 7: PE_t-IT₅₀- værdier for diquat og bromoxynil med tilhørende 95% konfidensintervaller.

a) Kan ikke estimeres, da færre end to partielle responser. Samtlige dyr var immobile ved efter eksponering for en puls af 6 timeras varighed.

b) Konfidensinterval kan ikke estimeres.

Diquat er i alt testet i seks koncentrationer fra 32-64 μg/l, men kun resultater af de tre højeste koncentrationer er vist i Tabel 7 og Figur 17. For resultater af samtlige test henvises til Bilag 4.1.7 og Bilag 4.2.5. Ved de indledende forsøg, hvor diquat blev testet i koncentrationerne 32-40 μg/l, kunne der ikke ses nogen klar sammenhæng mellem eksponeringstider og koncentration. Effekten var større ved en eksponering for 32 μg/l end en eksponering for 36 μg/l, og responset efter en eksponering for 40 μg/l minder om responset, der ses efter en eksponering for 32 μg/l. Disse forsøg indikerede dog, at der efter eksponeringen for diquat vil være en forsinket effekt i form af en stigende dødelighed.

Med baggrund i disse observationer, blev iværksat yderligere forsøg med højere koncentrationer. Disse forsøg viste, at efter en eksponering for en puls af 6 timers varighed og en koncentration på enten 46 μg/l, 55 μg/l eller 64 μg/l var der henholdsvis 30%, 80% og 75% immobile dyr umiddelbart efter eksponerings ophør (Figur 17). I de resterende grupper var der stort set ingen respons ved t = 0, men tendensen, som blev set ved de lavere koncentrationer, blev nu så udtalt, at en egentlig forsinket negativ effekt nu kunnne observeres i grupper udsat for pulsvarigheder på 2 timer eller mere. PE_t-IT₅₀ værdierne kunne dog, som vist i Tabel 7, ikke beregnes for alle koncentrationer, men af Figur 17 fremgår det tydeligt, at responset 24 timer efter pulsens ophør tiltog både i form af immobilitet og dødelighed. Efter 48 timer døde de dyr, der tidligere var immobile (95-100% af de dyr, der har modtaget pulse af 4-6 timers varighed er døde uafhængig af koncentrationen). Efter eksponering for en puls af 2 timers varighed var andelen af døde dyr efter 48 timer, hhv. 37%, 95% og 100% for de tre testede koncentrationer (Figur 17).

Figur 17: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for diquat (46, 55 og  64 μg/l). Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

Ved pulstest med bromoxynil blev der set en markant effekt på mobiliteten efter eksponeringen for en puls af 6 timers varighed, og dødeligheden steg i tiden efter eksponeringen (Figur 18).

Figur 18: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 26 mg/l bromoxynil. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

Af Figur 18 fremgår ligeledes, at der var forsinkede effekter efter 24 og 48 timer hos de grupper, der har fået en puls af kortere varighed (1-4t). Ved koncentrationen 26 mg/l genvinder størstedelen af dyr eksponeret i 4 timer mobiliteten efter 24 timer, men for de øvrige testede koncentrationer viser de beregnede PE_t-IT₅₀- værdier for bromoxynil (Tabel 7 og Bilag 4.1.8) ingen forskelle fra tiden t = 0 timer til tiderne t = 24 timer og t = 48 timer.

Tabel 8: PE_t-IT₅₀- værdier for referencestofferne 4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol med tilhørende 95% konfidensintervaller.

Ved pulstest med 4-nitrophenol, blev der set effekter i form af immobilitet og dødelighed efter pulseksponeringer af 4-6 timers varighed (Figur 19 og Bilag 4.2.7). Med tiden efter eksponering ændredes effekten fra at være domineret af immobilitet (0 timer) til udelukkende at omfatte dødelighed (48 timer). Ligeledes blev der set forsinkede effekter efter eksponeringen for pulse af kortere varighed end 4 timer, når dyrene havde opholdt sig 48 timer i rent medie. PE_t-IT₅₀-værdierne viser en forskel fra tiden t = 0 timer til tiden t = 24 timer (Tabel 8 og Bilag 4.1.9), hvor de beregnede PE_t-IT₅₀ værdier stiger med tiden, men denne tilsyneladende restitution dækker altså over, at dødeligheden øges markant efter 24 timer og 48 timer i rent medie (Figur 19).

Figur 19: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 16 mg/l 4-nitrophenol. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

For alle de tre testede koncentrationer af 3,5-dichlorophenol (Figur 20 og Bilag 4.2.8) blev set en effekt på mobiliteten hos dafnier eksponeret mere end 1 time. I grupper, der fik en puls af 4-6 timers varighed, var der fra 80-100% immobile til tiden t = 0 timer. Generelt genvandt dyrene deres mobilitet under observationsperioden, men efter 48 timer i rent medie var 25% af dyrene udsat for 6 timers eksponering af 3,1 mg/l stadig immobile. De beregnede PE_t-IT₅₀ værdier efter 0 timer (PE_0t-IT₅₀) er mindre end værdierne efter 24 timer (PE_24t-IT₅₀) for de testede koncentrationer (Tabel 8 og Bilag 4.1.10), som dog kun dækker et meget snævert interval (2,9-3,3 mg/l).

Figur 20: Fordeling af mobile, immobile og døde dafnier (angivet i %) efter 0t, 24t og 48t posteksponering for 3,1 mg/l 3,5-dichlorophenol. Ved hver eksponering blev anvendt 20 dyr, mens der var 30 dyr i kontrolgrupperne.

4.4 Opsummering af forsinkede effekter af pulseksponering

I Tabel 9 er resultater af pulstest med immobilisering som effekt angivet som ”recovery/restituering”, ”forsinket negativ respons” eller ”intet forsinket respons” vurderet ud fra de opnåede PE_t-IT₅₀-værdier. Dafnier eksponeret for enten dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat, bromoxynil, 4-nitrophenol eller 3,5-dichlorophenol genvandt mobiliteten under observationsperioden (restituerede). Dette blev indikeret ved stigende PE_t-IT₅₀-værdier med stigende observationstider. Ud fra den grafiske fremstilling er dette dog kun at se for dimethoat, pirimicarb (Figur 21-22 samt Figur 9, 10, 11 og 12 Bilag 5), esfenvalerat og 3,5-dichlorophenol.

Både eksponering for diquat, chlorpyrifos (3 μg/l) og pyrazophos viste en forsinket negativ effekt under observationsperioden, dette blev både afspejlet i de beregnede PE_t-IT-værdier samt i den grafiske fremstilling. For azoxystrobin blev der ikke konstateret forskelle i mobiliteten ved de anvendte koncentrationer efter eksponeringens ophør.

Tabel 9: Oversigt over forsinkede effekter på mobiliteten af Daphnia magna for 10 stoffer testet i pulstest med 48 timers posteksponeringsperiode.

4.5 Gentagne pulse

Resultaterne af forsøg med gentagne pulseksponeringer med dimethoat (20 mg/l) ses i Figur 21 og øvrige grafer er vist i Bilag 5.1.1. Umiddelbart efter den første puls var henholdsvis 25%, 95% og 100% af dyrene immobile efter en puls af henholdsvis 2, 4 og 6 timers varighed. Efter 24 timer var der 15%, 30% og 40% immobile i de samme grupper og situationen ændredes ikke efter 48 timer på nær i gruppen, der fik en puls på 2 timer, hvor der var 5% døde og ingen immobile. Den anden puls havde en større effekt end den første. Umiddelbart efter pulseksponeringens ophør var der 100% effekt efter en puls på 4 og 6 timer og 30% 15% og 60% effekt i grupperne, der modtog en puls på 0,5, 1 og 2 timer.

effekten var hovedsagelig i form af immobilisering, men ved de tre længste eksponeringstider var der 15%, 10% og 35% døde (2, 4 og 6 timer). I løbet af den anden posteksponeringsperiode steg andelen af døde dyrene, således at der efter 48 timer var 25%, 75% og 85% døde ved de tilsvarende tider. Selv ved de laveste eksponeringstider er andelen af døde markant større 48 timers efter anden pulseksponering (25% for både 0,5 og 1 times eksponering).

Figur 21: Gentagne pulseksponeringer med dimethoat 20 mg/l med 48 timers mellemrum.

De beregnede PE_t-IT₅₀-værdier med tilhørende konfidensintervaller (Tabel 11) viser tegn på en koncentrationsafhængig forskel i responset. Således er PE_t-IT₅₀-værdierne beregnet for 10 mg/l dimethoat højere end de tilsvarende værdier beregnet for 20 mg/l dimethoat. Dette er gældende for både første og anden puls.

Resultaterne for gentagne pulseksponeringer for pirimicarb fremgår af Figur 22 (70 μg/l), mens øvrige resultater er vist i Tabel 11 og Bilag 5.1.2.

Figur 22: Gentagne pulseksponeringer med pirimicarb (70 μg/l) med 48 timers mellemrum.

Tabel 11: Beregnede PE_t-IT₅₀ med tilhørende 95% konfidensintervaller for dafnier henholdsvis <24t for to gentagne pulse dimethoat, esfenvalerat, pirimicarb og pyrazophos.

a) Kan ikke estimeres, da færre end to partielle responser.

Eksponeringen for 70 μg/l pirimicarb (Figur 22) resulterede i at 100% af dyrene blev immobile i grupperne, der modtog en puls af 2-6 timers varighed. Efter 48 timer faldt responset til 10%, 5% og 15% i de tre grupper. I 6 timers gruppen var der 10% af responset, der skyldes dødelighed og i 4 timers gruppen skyldtes hele responset dødelighed. Endnu en puls resulterede i henholdsvis 21%, 100% og 95% respons i de samme grupper. Henholdsvis 11% og 15% af responset kunne tilskrives dødelighed i 4- og 6 timers grupperne. Alle dyrene i 2 timers gruppen kom sig i løbet af 24 timer, men i 4- og 6 timers gruppen var der 45% og 55% af dyrene, der stadig var påvirket efter 24 timer, heraf var henholdsvis 17% og 20% døde. Situationen er stort set uændret efter 48 timer. De beregnede PE_t-IT₅₀-værdier for den anden pulseksponering for pirimicarb er lavere end for den første. For pirimicarb er der, som det var tilfældet for dimethoat, fundet lavere PE_t-IT₅₀-værdier ved en koncentrationsstigning.

Figur 23: Gentagne pulsekponering med esfenvalerat (10 μg/l) med 48 timers mellemrum.

Resultaterne for gentagne pulseksponeringer af Daphnia magna for esfenvalerat ses i Figur 23. Eksponeringen medførte et markant indledende respons ved eksponeringstider >2 timer, hvor der var henholdsvis 50% og 79% immobile. Efter 24 timer var responset faldet ved de længste eksponeringstider (4 og 6 timer), men steget hos de lavere eksponeringstider. Endnu en puls af esfenvalerat efter 48 timer, havde en endnu mere udpræget effekt på dyrene. Således blev et respons på 100% observeret umiddelbart efter eksponeringen (t = 0) for en puls af 4 og 6 timers varighed hvoraf 20% og 26% skyldes dødelighed. Tilsvarende er der 40%, 50% og 80% respons efter 0,5, 1 og 2 timers eksponering, hvoraf 15% er dødelighed i 0,5 timers gruppen og 5% er dødelighed i de to andre grupper. Efter en posteksponeringsperiode på 24 timer er responset stort set uændret i alle grupperne, dog er der tale om en stigning i dødeligheden i grupperne eksponeret for en puls af 4 og 6 timers varighed. Efter 48 timer er dødeligheden endnu mere markant i samtlige grupper. Således ses 50%, 65%, og 85% døde i grupperne eksponeret for en puls af 0,5, 1 og 2 timers varighed og 100% dødelighed ved grupper eksponeret for en puls af 4 og 6 timers varighed.

De beregnede PE_t-IT₅₀ -værdier for esfenvalerat (Tabel 11) viser, at den anden pulseksponering medfører en endnu lavere mobilitet end ved første puls. Dyrene får det desuden værre med tiden, som også vist i Figur 23, idet PE_t-IT₅₀ falder fra 0,88t [0,72; 1,03] til 0,63t [0,53; 0,72]efter en observationstid på 24 timer og til 0,47t [0,35; 0,57] timer efter en observationstid på 48 timer.

Et eksempel på resultater opnået ved gentagne pulseksponeringer med pyrazophos er vist i Figur 24, men øvrige resultater er vist i Tabel 11 og Bilag 5.1.4.

Figur 24: Gentagne pulseksponering med pyrazophos (5 μg/l) med 48 timers mellemrum.

Efter en enkelt puls var der allerede efter endt eksponering 100% immobile dyr i grupperne, som fik en puls af 4-6 timers varighed. Responset var stort set uændret i disse grupper efter 48 timer i rent medie. Endnu en pulseksponering med samme koncentration resulterede ligeledes i et respons i grupper, der modtog pulse af 1-2 timers varighed. Efter 48 timer var det samlede respons stort set uændret i grupperne, men der skete en markant stigning i andelen af dyr, der var døde. Der var således henholdsvis 10%, 32%, 90% og 100% døde dyr ved de fire længste eksponeringstider. De beregnede PE_t-IC₅₀-værdier viste ingen forskel fra tiden 0 timer til tiden 24 timer eller 48 timer. Der ses dog et fald i de beregnede værdier med stigende koncentration. Værdierne falder ligeledes fra puls nr.1 til puls nr. 2 (Tabel 11).

4.6 Pulseksponering – aldersvariation i følsomhed

Dafnier indenfor fire aldersgrupper (<24t, 3d, 5d dog 7d) blev eksponeret for en puls af pirimicarb for at teste en evt. variation i følsomheden blandt disse grupper. Testkoncentrationerne blev valgt ud fra den indledende akuttest med pirimicarb (Tabel 3). Under akuttesten blev IC_90,24t bestemt til 29 μg/l, og efter 6 timer var 25% af dafnierne eksponeret for 30,0 μg/l (den højeste testkoncentration under akuttesten) immobile (60% af disse var døde). Til aldersforsøgene blev en koncentration på 40 μg/l derfor anvendt, for at sikre, at der ville være et respons, også hvis dyrene (ældre end 1 dag) skulle være mindre følsomme. Forsøget blev efterfølgende gentaget med en koncentration på 70 μg/l.

Tabel 12 viser andelen af immobile og døde blandt dafnier af forskellige aldersgrupper. Den største følsomhed overfor en puls af pirimicarb på 40 μg/l, blev set hos dafnier, der var 3 dage gamle på eksponeringstidspunktet (70% immobile), og den mindste følsomhed hos 5 dage gamle dyr (40% immobile). Såvel 24 timer som 48 timer efter eksponeringens ophør var der stort set ingen immobile eller døde dyr på nær i gruppen med 3 dage gamle dafnier, hvor der var henholdsvis 30% og 25% immobile efter 24 og 48 timer. Ved en koncentration på 70 μg/l var responset størst hos dafnier, der var <24 timer gamle, hvor 65% var immobile sammenlignet med 0% immobile i gruppen med 3 dage gamle dafnier, og 15% immobile i grupperne med henholdsvis 5 og 7 dage gamle dafnier. 48 timer efter eksponeringen var andelen af immobile dafnier faldet i alle grupperne. Der var dog stadig størst respons i gruppen med <24 timer gamle dafnier (15% immobile), men samtidig var der 10% døde i gruppen med 7 dage gamle dyr.

Tabel 12: Andelen af immobile/ døde dafnier (i procent) indenfor forskellige aldersklasser efter pulseksponering for pirimicarb (6 timers varighed). n=20 for eksponerede grupper og n=30 for kontrolgrupperne.

a) Antal dyr: n=29.

Forsøget blev gentaget med vægt på sammenligning af <24 timer og 3 dage gamle dafnier (alderen dyrene har når de modtager en gentagen puls), der blev eksponeret for en puls af pirimicarb eller dimethoat. Resultaterne fremgår af Tabel 13 og 14, hvor data for eksponeringen af <24 timer gamle dafnier er medtaget - både for enkelt pulstest og gentagne pulstest. Værdierne fundet for 3 dage gamle dafnier, der er blevet eksponeret for 10 mg/l dimethoat (Tabel 13) ligner de værdier, der er fundet for <24 timer gamle dafnier. De beregnede PE_t-IT₅₀-værdier for 0 timer er højere for dyr eksponeret for 10 mg/l end dyr eksponeret for 20 mg/l. Med tiden bliver forskellen mindre tydelig.

Eksponering for pirimicarb (Tabel 14) viser ikke en forskel i responset mellem dafnier, der er <24 timer gamle, og dafnier, der er 3 dage gamle. PE_t-IT₅₀- værdierne beregnet for dyr eksponeret for 40 μg/l er højere end værdierne beregnet for 70 μg/l, til tiden 0 timer, men til tiderne 24 timer og 48 timer er der ingen forskel.

Tabel 13: Beregnede PE_t-IT₅₀ med tilhørende 95% konfidensintervaller for dafnier henholdsvis <24t og 3 dage gamle eksponeret for dimethoat. Bemærk at data i denne tabel ikke er identiske med data i Tabel 5, da der i denne undersøgelse blev udført nye forsøg.

^a) Fundet i pulstest.

^b) Fundet for første 1. puls i test med gentagen pulseksponering.

^c) Kan ikke estimeres p.g.a. datas beskaffenhed.

Tabel 14: Beregnede PE_t-IT₅₀ med tilhørende 95% konfidensintervaller for dafnier henholdsvis <24t og 3 dage gamle eksponeret for pirimicarb. Bemærk at data i denne tabel ikke er identiske med data i Tabel 5, da der i denne undersøgelse blev udført nye forsøg.

^a) Fundet i pulstest.

^b) Fundet for første 1. puls i test med gentagen pulseksponering.

^c) Kan ikke estimeres pga. datas beskaffenhed.

4.7 Langtidseffekter af pulseksponering

Der er i alt udført 12 forsøg med pulseksponering, hvor dyrene efterfølgende har været observeret i 21 dage i rent medie. Stofferne dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat, chlorpyrifos, bromoxynil og 4-nitrophenol er blevet undersøgt. For flere af teststofferne blev der ikke observeret langtidseffekter, og samtlige data vil af pladshensyn ikke blive præsenteret i det følgende. Der vil blive fokuseret på de stoffer, hvor effekter blev fundet, og for resultater af alle de gennemførte test henvises til Bilag 6.

Under testene med dimethoat og pirimicarb, blev der tilført alge i overskydende mængder (>0,2 mg C/dag), mens der i de øvrige tests blev fodret i henhold til anbefalingen for reproduktionstest med dafnier (OECD, 1998).

4.7.1 Antal afkom efter pulseksponering

Der blev udført to test med dimethoat ved koncentrationen 30 mg/l, da det ved den første test ikke var muligt at opfylde OECD kravet om minimum 60 unger pr. moderdyr. Den første test viste dog, at antallet af unger var markant lavere hos dafnier, der 14 dage tidligere havde modtaget en puls af 3 timers varighed. 21 dage efter pulseksponeringen var der forskel ved alle eksponeringstider på nær hos dafnier eksponeret 1 og 2,5 time. Anden test med dimethoat (30 mg/l) viste ingen forskelle i antallet af afkom efter 14 dage, men efter 21 dage havde alle grupper eksponeret for en puls ≥2 timer produceret markant færre unger end kontrolgruppen (Figur 25). Pulseksponering af dafnier med pirimicarb (100 μg/l) viste et markant fald i antallet af unger pr. moderdyr efter såvel 14 dage som 21 dage hos grupper, der modtog en puls af 2-6 timers varighed (Figur 25). Pulseksponeringen for 3,5-dichlorophenol (1-6 timer) havde en effekt på antallet af afkom efter 14 dage, mens der efter 21 dage ikke var forskel i antallet af unger produceret som funktion af eksponering for 3,5-dichlorophenol. Hverken efter 14 dage eller 21 dage var antallet af unger fra dyr pulseksponeret med chlorpyrifos, bromoxynil eller 4-nitrophenol forskelligt fra kontrolgrupperne.

Figur 25: Antal unger og længde af moderdyr 21 dage efter pulseksponering med dimethoat (30 mg/l) og pirimicarb (100 μg/l). Gennemsnit og 95% konfidensintervaller er vist (n=10).

4.7.2 Antal dage før første reproduktion

En puls af dimethoat (30 mg/l) af 3 timers varighed forlængede antallet af dage før første afkom fra i gennemsnit 7,70 dage til 9,17 dage (Tabel 15). Pulseksponeringer af kortere varighed medførte ligeledes forsinkelser i reproduktionen, men ikke helt så markant som efter eksponeringen for en puls af 3 timers varighed. Eksponering for 100 μg/l pirimicarb i pulse med varigheder fra 1-6 timer medførte tilsvarende en forsinkelse i antallet af dage før første reproduktion. Kontrolgruppen fik i gennemsnittet deres første afkom efter 8,10 dage sammenlignet med 9,20-9,60 dage for de eksponerede grupper. Af de øvrige testede stoffer (esfenvalerat, chlorpyrifos, bromoxynil, 4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol) var det kun for 4-nitrophenol, at der kunne ses tegn på en effekt på antallet af dage før første reproduktion (2 mg/l (0,5, 4 og 6 timer) samt 8 mg/l (1 og 6 timer)). Der ses dog ingen entydig sammenhæng mellem pulsvarigheden og antallet af dage. Det ses desuden at de grupper, der fik en pulseksponering for enten dimethoat eller pirimicarb, får deres første kuld efter omkring samme tid som kontrolgrupperne for chlorpyrifos, esfenvalerat, bromoxynil, 4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol. At moderdyr i kontrolgrupperne for dimethoat og pirimicarb får unger tidligere end moderdyr i de øvrige forsøg, kan hænge sammen med den øgede fodermængde, der blev tilført under disse forsøg (se afsnit 3.5.6). Der blev dog ikke set nogen forskel på effekten af pulseksponeringer hos fodrede og ikke fodrede dyr, og fodring skulle ud fra disse forsøg ikke have nogen betydning.

Tabel 15: Gennemsnitlig antal dage før første reproduktion, med tilhørende 95% konfidensintervaller, efter pulseksponering med udvalgte pesticider og referencestoffer.

4 NP: 4-nitrophenol; 3,5 DCP: 3,5-dichlorophenol

a) ikke bestemt

4.7.3 Kropslængde og vægt efter pulseksponering

Som vist i Figur 25, reducerede en dimethoat eksponering på 30 mg/l længden af moderdyrene efter 21 dage for alle pulsvarigheder (1-3 timer). Af samme figur fremgår det, at en pirimicarb eksponering på 100 μg/l tilsvarende reducerede længden af moderdyrene efter 21 dage for pulsvarigheder af 3-6 timer. Pulseksponeringer for esfenvalerat, chlorpyrifos, bromoxynil og 4 nitrophenol viste ingen effekt på længden af moderdyr efter 21 dage.

Vægten af overlevende moderdyr blev ikke påvirket af pulseksponeringer for de her undersøgte pesticider (dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat, chlorpyrifos, bromoxynil og 4 nitrophenol).

4.7.4 Antal unger, eksponeringstid og kropslængde

Som beskrevet i metodeafsnittet blev det undersøgt om der var en sammenhæng mellem antallet af unger, eksponeringstiden og kropslængden. Parameterestimater for hhv β_{eksponeringstid} og β_længde er angivet i Tabel 16.

Det fremgår af tabellen, at der for stofferne bromoxynil, chlorpyrifos, 4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol ikke er en statistisk signifikant sammenhæng mellem eksponeringstiden og antallet af afkom. For dimethoat betød en øget eksponeringstid et signifikant fald i antallet af unger der blev produceret i løbet af de 21 dage testen forløber over (p = 0.002). En tilsvarende effekt sås efter eksponeringen for pirimicarb (p = 0.007). Tilsvarende ses der en signifikant sammenhæng mellem det producerede antal unger og moderdyrets længde efter 21 dage hos dafnier eksponeret for henholdsvis dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat, chlorpyrifos og 3,5-dichlorophenol. Dafnier, der har haft en reduceret vækst, og dermed kortere kropslængde efter 21 dage, producerer således signifikant færre unger (p = 0,001 (dimethoat), p < 0,001 (pirimicarb), p = 0,0024 (chlorpyrifos), p =0,024(esfenvalerat) og p = 0,0036 (3,5-dichlorophenol)) end dafnier, der opnår en større kropslængde i løbet af forsøgsperioden.

Tabel 16: Parameterestimater for længde og eksponeringstid for de enkelte stoffer i test for kronisk virkning.

*signifikant forskellig fra kontrollen

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 August 2006, © Miljøstyrelsen.