| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Toksiske effekter af pulseksponering af pesticider - akutte og kroniske effekter hos Daphnia magna

5 Diskussion

• 5.1 Testudvikling
  • 5.1.1 Endpoints for effekter af pulseksponering
  • 5.1.2 Fodring i posteksponeringsperioden
  • 5.1.3 Alder og følsomhed
  • 5.1.4 Gentagne pulse
• 5.2 Effekter af enkeltstoffer efter pulseksponering
  • 5.2.1 Dimethoat
  • 5.2.2 Pirimicarb
  • 5.2.3 Chlorpyrifos
  • 5.2.4 Esfenvalerat
  • 5.2.5 Pyrazophos
  • 5.2.6 Azoxystrobin
  • 5.2.7 Diquat
  • 5.2.8 Bromoxynil
  • 5.2.9 4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol
• 5.3 Perspektiver og anbefalinger i relation til risikovurdering og godkendelse af pesticider
  • 5.3.1 Effekter af pulseksponeringer - et nyt internationalt forskningsområde
  • 5.3.2 Pulsvarighed og - koncentration
  • 5.3.3 Observationstid efter pulseksponering
  • 5.3.4 Risiko for effekter som følge af pulseksponering
  • 5.3.5 Godkendelse og pulseksponering
  • 5.3.6 Gentagne pulse

5.1 Testudvikling

En meget væsentlig del af nærværende projekt har været fokuseret på udvikling af en testmetodik til påvisning af toksiske effekter af pulseksponering. Den endelige metode er beskrevet i detaljer i testprotokollen i Bilag 1, og der vil i det følgende blive givet en diskussion af væsentlige forhold og overvejelser, der har indgået i testudviklingen.

Generelt vurderes det, at de anvendte tests er lette at udføre indenfor en overskuelig tidsramme (3 dage for akut virkning og 21 dage for kronisk virkning), der anvendes få materialer, og Daphnia magna har vist sig som en velegnet testorganisme. Metodemæssigt er der et vist overlap mellem de gennemførte undersøgelser og den metode Naddy et al. (2000) har anvendt. Deres studie er dog ikke fokuseret mod udvikling af en egentlig testmetodik, men snarere mod beskrivelse af effekten af et enkelt pesticid (chlorpyrifos), og der kan derfor stilles spørgsmålstegn ved generaliseringsværdien af undersøgelserne udført af Naddy et al. (2000). I denne sammenhæng er det af stor betydning, at der for chlorpyrifos ikke blev observeret hverken forsinkede eller kroniske effekter, hvorfor yderligere dokumentation af metoden anvendt af Naddy et al. (2000) har været nødvendig for at vurdere, om metoden er egnet til generelt at beskrive effekter af pulseksponeringer med pesticider. Testmetodikken i Naddy et al. (2000) forekommer umiddelbart at være ganske omstændig og er ikke optimeret i forhold til brug i regulatorisk sammenhæng.

Den opkobling til ISO/OECD-metoder, der er anvendt i nærværende rapport, vurderes at give et mere effektivt testdesign uden at væsentlige informationer mistes. Som et eksempel kan nævnes, at de præliminære ISO-test med hyppige observationer indenfor de første 24 timer understøtter valg af relevante testkoncentrationer, således det i vidt omfang blev undgået, at de ressourcekrævende kroniske test blev udført som ”trial-and-error”-forsøg. Dog skal esfenvalerat nævnes som en undtagelse, idet dette stof p.g.a. af ringe vandopløselighed, og sandsynligvis også høj biokoncentrering, voldte problemer ved gennemførslen af kroniske test.

5.1.1 Endpoints for effekter af pulseksponering

I de udførte undersøgelser, blev mobiliteten anvendt som endpoint til vurdering af akutte effekter. I overensstemmelse med ISO-standarden for dafnietest (ISO, 1989a), blev det defineret, at dyrene var immobile, hvis de ikke var i stand til at svømme i løbet af en 15 sekunders periode efter evt. stimulering. Problemet ved at benytte immobilitet er, ud over at det er en mere eller mindre subjektiv vurdering, at nogle dyr måske nok kan svømme, men samtidig udviser en svømmeadfærd, der tydeligvis er forskelligt fra kontrolgruppens adfærd. Vi så således både dyr, der generelt var mere sløve, men også dyr, der svømmede mere ved bunden og i mere roterende bevægelser. Der er ingen tvivl om, at disse dyr har været påvirket af pesticideksponeringen, men da den internationalt accepterede definition på mobilitet blev fastholdt gennem hele studiet, var det ikke muligt at inddrage dette respons i de endelige resultater. Hvis forsøgene var blevet udvidet til at definere en grad af immobilitet som f.eks. mobile (kontrol), mobile (ikke kontrol) og immobile, og rangordnet i henholdt til ”mobilitetsstatus” med værdier (f.eks 0: mobile (kontrol); 1: mobil (ikke kontrol); 2: (immobile)) kunne vi have beregnet en slutværdi for hver gruppe af dafnier (som i flg. eksemplet ville ligge mellem 0 og 2), og som ville fortælle os graden af mobilitet i hver gruppe. Dette ville alt andet lige have resulteret i lavere effekttider og -koncentrationer, end de vi har bestemt ud fra resultaterne i denne undersøgelse. Et andet alternativ ville være at finde et andet endpoint end immobilitet som f.eks. svømmeevne bestemt ved metoden beskrevet af Lauridsen et al. (2003). Det vurderes dog, at denne ændring af pulstestene ville føre til mere arbejds- og omkostningskrævende test, og det meget nære ”slægtskab” med eksisterende internationalt accepterede testmetoder vil også gå tabt ved denne ændring.

I forbindelse med en evt. restitution eller en forsinket negativ effekt er det dog nødvendigt at evaluere de anvendte observationstider. I de her udførte test anvendte vi en observationsperiode på 48 timer. De kroniske forsøg med esfenvalerat viste imidlertid, at der efter 48 timer stadig kan ske en ændring i responset. Vi så således en øget dødelighed også selv om der var tale om et recovery i løbet af de første 24 timer efter pulseksponeringer for esfenvaleratkoncentrationer på 1,00-20,0 μg/l. De beregnede PE_t-IT₅₀-værdier for de tilsvarende koncentrationer (Bilag 4) viste dog tegn på en yderligere ændring i tidsrummet 24-48 timer. Til sammenligning fandt Naddy & Klaine (2001), at det var nødvendigt med en observationsperiode på mindst 72 timer for at opnå et recovery hos Daphnia magna efter eksponeringer for 0,5 μg/l chlorpyrifos og 96 timer ved en koncentration på 1,0 μg/l. Altså er det for visse stoffer vist, at der kræves en længere observationsperiode efter pulseksponering ved stigende koncentrationer for endeligt at afgøre effekterne af en pulseksponering. Esfenvalerat og chlorpyrifos er klart de mest lipofile af de stoffer, der er testet i nærværende undersøgelse, og længden af den krævede observationsperioden kan meget vel være relateret til teststoffernes fysisk-kemiske egenskaber, hvor fedtopløsligheden (K_ow-værdien) kan vise sig at være nøgleparameteren. Undersøgelser af relationer mellem fysisk-kemiske stofegenskaber og effekter af pulseksponering er yderst relevante, men falder dog uden for rammerne af nærværende projekt.

De udførte pulstests med reproduktion som endpoint, viste at eksponeringen for stoffer (dimethoat og pirimicarb) som dafnierne umiddelbart var i stand til at komme sig efter, havde en kronisk effekt på reproduktionen. Vi så således et fald i antallet af afkom samt en forsinkelse i reproduktionen. Ligeledes påvirkede eksponeringen dyrenes vækst således at de eksponerede dyr opnåede en kortere længde i løbet af de 21 dage testen forløb over. Statistiske undersøgelser viste ligeledes, en sammenhæng mellem både kropslængde og pulsvarigheden og antallet af unger, der blev produceret, og der er gode perspektiver i at forfølge denne indfaldsvinkel til forudsigelse og fortolkning af reproduktionseffekter af pulseksponering. De kroniske tests kunne desuden udvides til at inkludere reproduktionsevnen hos afkom. Der er i litteraturen beskrevet undersøgelser (kontinuert eksponering 21 dage), hvor anden og tredje generations afkom er blevet inddraget, og hvor effekter i den videre reproduktion er blevet iagttaget (bl.a. Sánchez et al., 1999; Hammer-Wirtz & Ratte, 2000), og det kunne være interessant at se, om dette også er tilfældet efter pulseksponeringer.

5.1.2 Fodring i posteksponeringsperioden

Som et led i testudviklingen blev det undersøgt om fodring i posteksponeringsperioden påvirkede resultaterne opnået ved pulstest. Fodring er en nødvendighed for test af en varighed >48 timer, når der anvendes nyfødte dyr, og er således uundgåelig for test med gentagne pulseksponeringer og test til undersøgelse af kroniske effekter af pulseksponering. For pulstest med immobilisering som endpoint var udgangspunktet, at fodring ikke skulle foretages, da fordelingen af teststof mellem dyr og testmedium kunne forstyrres af dette, og der heller ikke i metodeoplægget har været anvendt fordring (Friis-Nielsen, 2002; Brent & Herricks, 1999). I litteraturen er der eksempler på, at tilstedeværelsen af føde kan øge den toksiske virkning af et stof (Naddy & Klaine, 2001), men tilsvarende er der også eksempler på, at toksiciteten kan blive nedsat (Buhl et al., 1993). Fodringsforsøgene med pirimicarb viste en hurtigere restitution blandt fodrede dyr sammenlignet med dyr, der ikke blev fodret. I modsætning til disse resultater blev der ikke fundet en forskel mellem fodrede og ikke-fodrede dyrs recovery efter eksponeringen for dimethoat. Dyrene, der blev eksponeret for pirimicarb, fik imidlertid en længere eksponering (6-8 timer) end dyrene eksponeret for dimethoat (3-6 timer). Det kunne derfor tyde på at føde kun har en indflydelse på recovery efter pulse af en given varighed (i dette tilfælde >6 timer). Det er dog mere sandsynligt, at variationen skyldes de anvendte koncentrationer og pesticidet. På baggrund af disse undersøgelser blev det besluttet, at fodre dyrene under pulstestene efter de var blevet overflyttet til rent medie. Idet fodring først foretages efter eksponeringen er afsluttet vurderes det, at fodringen kun har ringe indfyldelse på teststoffets fordeling mellem vandfasen og organismerne.

5.1.3 Alder og følsomhed

I de internationale standarder for dafnietestning (f.eks. ISO (1989a) og OECD (1998)) anvendes dafnier der er <24 timer gamle. Hovedparten af den tilgængelige information om kemiske stoffers toksiske virkning på Daphnia magna omhandler således eksponerering af juvenile dyr. Naddy et al. (2000) fandt imidlertid forskelle i testorganismernes respons overfor pulseksponeringer med chlorpyrifos afhængigt af dyrenes alder på eksponeringstidspunktet. Således var 3, 7 og 14 dage gamle dyr mere følsomme end nyfødte unger og udviste større dødelighed i en 21-dages test. Derfor blev der udført forsøg med 4 aldersklasser (<24t, 3d, 5d og 7d) af Daphnia magna i nærværende undersøgelse. I forsøg med pirimicarb i koncentrationen 40,0 μg/l blev det fundet, at dyr, der var 3 dage gamle, var de mest følsomme overfor pulseksponeringen, men at de <24 timer gamle dyr også havde en markant grad af immobilisering. Disse dyr kom sig dog hurtigere end de 3 dage gamle dyr, hvilket peger på <24 timer gamle dyr som værende mindre følsomme overfor pulseksponering med pirimicarb (6 timers puls ved 40 μg/l). Ved en eksponering for 70 μg/l var det dog tydeligt, at de <24 timer gamle dyr var de mest følsomme, og de 3 dage gamle dyr reagerede ikke på noget tidspunkt på en puls af denne koncentration. Derfor kan det ikke ud af de udførte forsøg udledes om ældre dyr er mere følsomme end unge dyr. Større følsomhed blandt voksne individer sammenlignet med juvenile er dog dokumenteret tidligere for invertebrater (A. aquaticus og G. pulex) eksponeret for ammoniak og hypoxi (Maltby 1995) og Naddy et al. (2000) fandt som tidligere nævnt også en større følsomhed bland 3, 7 og 14 dage gamle individer sammenlignet med <24 timer gamle. En større følsomhed hos nyfødte dafnier sammenlignet med voksne ægbærende dafnier er imidlertid blevet iagttaget efter eksponeringen for cypermethrin (Lauridsen et al. 2003).

Det har således ikke på baggrund af nærværende forsøg og litteraturgennemgang været muligt at nå frem til en entydig konklusion vedrørende følsomhed i relation til dyrenes alder på eksponeringstidspunktet. Ved projektets opstart blev det valgt at opbygge testudviklingen omkring <24 timer gamle dyr, og af hensyn til sammenlignelighed med eksisterende data fra internationalt standardiserede test anser vi det for mest hensigtsmæssigt at fastholde anvendelsen af <24 timer gamle dyr ved fremtidige pulstest.

Et andet forhold, som måske i højere grad end dyrenes alder, kan påvirke følsomheden, er dyrene skjoldskifte som følge af vækst. Eksponeres dyr (tilfældigvis) umiddelbart efter skjoldskifte vil kemiske stoffer nemmere kunne gennemtrænge overfladen og dermed vil dyrenes eksponering (interne dosis) kunne øges. Dette forhold udjævnes nok til en vis grad i test med kontinuert eksponering, men ved pulstest med så korte pulsvarigheder, som er anvendt i nærværende projekt, kan tidspunktet for skjoldskifte få afgørende betydning. Det er således en mulighed, at de størrelseforskelle inden for grupper, der observeres af Andersen et al. (2005) 3-9 dage efter ophøret af pulseksponering med dimethoat og pirimicarb, og som også er set i dette projekt efter 21 dage, kan henføres til, at en del af dyrene har skiftet skjold umiddelbart før eller under eksponeringen. Testteknisk kunne disse usikkerheder minimeres ved at synkronisere den anvendte kultur m.h.t. skjoldskifte eller ved at opnå en mere ensartet aldersfordeling blandt de <24 timer gamle dafnier, men under de givne forhold vurderes dette ikke at være praktisk gennemførligt. Ovenstående anbefaling af at anvende <24 timer gamle dafnier ved pulstest står derfor stadig ved magt, men det opfordres til at man ved fremtidige test har øget opmærksomhed på størrelseforskelle inden for grupper, der modtager samme puls.

5.1.4 Gentagne pulse

I litteraturen er fundet flere undersøgelser, der viser, at pulse i vandmiljøet kan optræde med korte eller længerevarende mellemrum. For eksempel fandt Liess et al. (1999), at der var betydeligt flere pulse af pesticider i vandløbet i perioden april til september, hvor pesticiderne også hyppigt blev anvendt på markerne. Phillips & Bode (2004) har ligeledes dokumenteret forekomsten af gentagne pulse af pesticider med maksimumskoncentration i juni til december i forbindelse med større regnvejrshændelser.

Spørgsmålet om effekter af gentagne pulspåvirkninger blev i løbet af projektperioden mere og mere påtrængende også set i lyset af, at der for flere af de undersøgte stoffer blev set et recovery efter eksponering for en enkelt puls. Information om længerevarende effekter, hos dyr der tilsyneladende havde overvundet pulspåvirkningen, blev opnået ved de forsøg, hvor dafniernes reproduktion blev observeret, men hvorvidt en gentagen pulspåvirkning vil have en forstærket effekt bliver ikke belyst ved denne testning. Som en sideaktivitet til det egentlige projekt blev derfor gennemført en række forsøg med gentagne pulseksponeringer.

De fire stoffer dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat og pyrazophos blev undersøgt i hvad, der må betegnes som indledende forsøg med gentagen eksponering, nemlig en simpel gentagelse af de allerede udførte pulsforsøg. Dyr, der allerede havde modtaget en pulseksponering, blev således udsat for endnu en puls af samme varighed og koncentration 48 timer efter afslutningen af den første eksponering. Som ventet blev der fundet en markant genvinding af mobiliteten efter en enkelt puls af både pirimicarb og dimethoat allerede indenfor de første 24 timer. Der er ingen forskel i responset efter 24 timer og 48 timer i rent medie, hvilket afspejler, at restitutionen sker indenfor de første 24 timer. Efter en gentagen eksponering var der tale om en mere udpræget immobilisering til tiden t = 0 timer. PE_t-IT₅₀-værdierne steg ligeledes med stigende posteksponeringstid, hvilket pegede i retning af restituering - dog var der ingen forskelle mellem posteksponeringstiderne. Den tidligere beskrevne forsinkede negative respons i form af et skift fra immobilisering til død fremgår således ikke af PE_t-IT₅₀-værdierne fundet for anden puls. Forsøg med gentagne pulse af pirimicarb og dimethoat viser altså, at selv om dyrene genvinder mobiliteten i løbet af 24 timer efter eksponeringens ophør, så er de tilsyneladende så svækkede, at de ikke i stand til at genvinde mobiliteten efter endnu en pulseksponering. For esfenvalerat og pyrazophos var genvindingen af mobiliteten efter første puls mindre udtalt end for dimethoat og pirimicarb, men der blev set samme tendens til at anden puls ændrede responset fra immobilisering til død.

Det blev valgt at eksponere dyrene igen lige efter den første pulseksponerings-periode var overstået. Det var dels af hensyn til sammenligning med allerede udførte forsøg og dels for at undgå, at dyrene begyndte at reproducere under testen. Det er muligt, at dyrene ville have udvist en større tolerance over for anden puls, hvis pulsintervallet havde været af længere varighed, således at restitueringsperioden ville have været længere. Ligeledes kan der være tale en aldersafhængig følsomhed, f.eks. beskriver Naddy & Klaine (2001), som nævnt ovenfor, at 3-14 dage gamle dafnier var mere følsomme overfor chlorpyrifos end <24 timer gamle dafnier. De udførte aldersforsøg i nærværende projekt viste dog som tidligere beskrevet ikke en entydig sammenhæng mellem dyrenes alder og deres følsomhed.

5.2 Effekter af enkeltstoffer efter pulseksponering

5.2.1 Dimethoat

De fundne værdier for toksiciteten af dimethoat i standardtest stemmer godt overens med, hvad der er beskrevet i litteraturen (se Tabel 1 samt Beusen & Neven 1989; Tomlin, 2003). Ved pulstest blev det påvist, at dyrene genvandt mobiliteten efter pulseksponeringer (10-30 mg/l), og denne effekt blev påvist efter at dyrene havde opholdt sig 24 timer i rent vand (PE_0t-IT₅₀< PE_24t-IT₅₀). En stigende koncentration medførte et fald i de fundne PE_t-IT₅₀-værdier, hvilket viser, at der skal kortere tid til at opnå en effekt på 50% af dyrene ved en stigning i koncentrationen fra 10 mg/l til 20 mg/l og 30 mg/l. Det første forsøg, hvor kroniske effekter af dimethoat blev undersøgt, opfyldte ikke validitetskravene fra OECD (1998) på 60 unger pr. moderdyr. Trods for dette kan det dog konkluderes, at der var signifikant færre unger i pulseksponerede grupper end i kontrollen. Den anden test for kroniske effekter af dimethoat bekræftede, at pulseksponeringer af mere end 2 timers varighed havde en effekt på antallet af unger pr. moderdyr efter 21 dage. Resultater fra tidligere undersøgelser med dimethoat, hvor undersøgelserne er udført efter retningslinierne i OECD (1998), har vist 50%’s hæmning i antal afkom ved eksponering for 310 μg/l efter 20 dage (Canton et al., 1980) og ligeledes efter eksponering for 310 μg/l efter 16 dage (Hermens et al., 1984). NOEC for reproduktionen af Daphnia magna efter 21 dages kontinuert eksponering er fundet til 40 μg/l (se Tabel 1). Vore forsøg dokumenterer, at pulseksponeringer i lighed med kontinuerte eksponeringer kan påvirke reproduktionen. Den anvendte koncentration på 30 mg/l er en faktor 100-1000 højere, men der skulle kun en eksponering af 2,5-3 timers varighed til for at reducere antallet af unger med ca. 30% sammenlignet med kontrollen. Det blev ligeledes observeret en forsinkelse i reproduktionen efter en puls på 3 timer (Tabel 15). D.v.s. dyrene, der fik den længste pulseksponering, fik unger på et senere tidspunkt (9,2 dage) end kontrol gruppen (7,6 dage). For dimethoat vil anvendelse af data fra test med kontinuert eksponering således føre til de mest konservative skøn over beskyttelseskoncentrationer. Nærværende projekt bidrager dog med den meget vigtige, og ikke tidligere beskrevne, information, at selv meget kortvarige eksponeringer kan medføre reproduktionsskader hos Daphnia magna.

5.2.2 Pirimicarb

Der blev fundet IC₅₀-værdier på 21,8 μg/l (24 timer) og 19,4 μg/l (48 timer) ved den standardiserede akuttest med kontinuert eksponering med pirimicarb. Værdierne stemmer godt overens med EC_50,48t på 17 μg/l opgivet i Tabel 1 samt værdierne bestemt af Kusk (1996) på 28 μg/l og 21 μg/l for henholdsvis 24 timer og 48 timer. Dafnier restituerede efter pulseksponeringer for pirimicarb, d.v.s. de genvandt deres mobilitet efter overførslen til rent medie. Såvel eksponeringstid som koncentration var betydende for immobilisering og den efterfølgende genvinding af mobiliteten. Ud fra resultaterne konkluderes det, at dyr udsat for pulse af pirimicarb hurtigere genvinder mobiliteten end dyr udsat for dimethoat efter overførslen til rent vand. Som tidligere nævnt binder begge stoffer sig til enzymet acetylcholinesterase, og da hydrolysen af carbamat er hurtigere end af organophosphat-bundne (se afsnit 2.2.3), vil det kunne forventes, at pirimicarb (carbamat) udskilles hurtigere end dimethoat (organophosphat). I overensstemmelse med dette fandt Kusk (1996) en markant frigivelse af pirimicarb efter overførslen af Daphnia magna til rent vand, hvor kun halvdelen af pirimicarb-mængden var tilbage i dyrene efter 24 timer.

Der blev produceret et lavere antal unger i løbet af de første 14 dage i grupper, der blev pulseksponeret (2-6 timer) med pirimicarb (100 μg/l). Ligeledes er der tale om en forsinkelse i reproduktionen efter eksponeringer for pirimicarb allerede ved eksponeringer af 1 times varighed. Dyrene i kontrolgruppen fik deres første kuld efter gennemsnitlig 8,1 dage og eksponerede grupper fik unger efter 9,2-9,6 dage. For test med kontinuert eksponering i 21 dage er fundet en NOEC på 0,9 μg/l, og som det var tilfældet for dimethoat vil anvendelse af denne værdi føre til et mere konservativt skøn over beskyttelseskoncentrationer i miljøet end data fra pulstestene. Dette er naturligvis forventeligt, når forskellen i eksponeringstiden (2-6 timer over for 504 timer) tages i betragtning, og derfor er den væsentlige nyhed i de fremkomne data fra pulseksponeringerne, at der kan opstå reproduktionsskabder, selv når dyrene udsættes for pirimicarb i meget kort tid.

5.2.3 Chlorpyrifos

Umiddelbart efter endt pulseksponering af Daphnia magna med chlorpyrifos var effekten på mobiliteten mindre markant end efter, at dyrene havde opholdt sig 24 timer i rent medie (PE_0t-IT₅₀>PE_24t-IT₅₀). Dette fortolkes som et forsinket tab af mobilitet, også selvom der ikke var øget immobilisering efter yderligere 24 timers ophold i rent medie (PE_24t-IT₅₀~PE_48t-IT₅₀). Kun til tiderne 24 timer og 48 timer er der tale om en koncentrationsafhængig forskel i responset, hvilket afspejles i en lavere PE_t-IT₅₀ værdi for 3 μg/l sammenlignet med 2,5 μg/l. Van der Hoeven & Gerritsen (1997) undersøgte evnen til recovery hos Daphnia pulex efter eksponeringen (1-3 dage) for chlorpyrifos. Resultatet af deres forsøg var, at et recovery næsten aldrig indtraf, og at dyrene ofte blev immobile efter eksponeringens ophør også selv om de var mobile til tiden t = 0 timer. Altså et mønster, der svarer til det, der i nærværende undersøgelse blev set efter pulseksponeringer. Van der Hoeven & Gerritsen (1997) fandt ingen effekter (hverken positive eller negative) efter kontinuerte eksponeringer for en koncentration på 0,5 μg/l. I modsætning til dette fandt Naddy & Klaine (2001) et recovery på >80%, op til 7 dage efter eksponeringen af Daphnia magna for en puls af chlorpyrifos (0,5 μg/l). Proceduren anvendt i nærværende undersøgelse ligner den anvendt af Naddy & Klaine (2001), dog blev chlorpyrifos testet i koncentrationer, der er 5-6 gange lavere. For chlorpyrifos viser de beskrevne studier sammenholdt med vore undersøgelser således, at det kun er muligt for dafnier at genvinde mobiliteten efter pulseksponeringer for chlorpyrifos under en vis koncentration, og at højere koncentrationer kan give anledning til forsinkede negative effekter. I lighed med undersøgelser udført af Naddy & Klaine (2001) blev der heller ikke i nærværende undersøgelse påvist effekter på de undersøgte parametre for reproduktionseffekter som følge af pulseksponering med chlorpyrifos, men det er værd at bemærke, at der ved kontinuert eksponering i 21 dage er fundet en NOEC på 0,052 μg/l (se Tabel 1).

5.2.4 Esfenvalerat

Esfenvalerat er et neurotoksin og virker som beskrevet i afsnit 2.2.2 ved at forlænge åbningen af Na⁺ kanaler i nervecellen så der opstår adskillige aktionspotentialer. Vi så også, at immobiliseringen blandt dafnierne viste sig i form kramper. IC₅₀,_24t og IC_50,48t for esfenvalerat blev beregnet til 1,58 μg/l og 0,70 μg/l. Værdien på 0,24 μg/l opgivet i Pesticide Manual for 48 timer (Tomlin, 2003) ligger indenfor det beregnede konfidensinterval [0,07; 1,53] for vores test, hvilket også er tilfældet for de 0,9 μg/l, der fremgår af Tabel 1.

Pulstestene med esfenvalerat (20 μg/l og 30 μg/l) viser en lille restituering i løbet af de første 24 timer af observationsperioden. Herefter forringes dyrenes tilstand noget (PE_t-IT₅₀-værdien falder), men der er stadig flere mobile dyr 48 timer efter pulseksponeringens ophør, end der var til t = 0 timer.

Under de indledende reproduktionstest med esfenvalerat (1 μg/l, 5 μg/l og 20 μg/l) blev der imidlertid observeret en så markant grad af immobilisering og dødelighed i løbet af de første 4-6 dage, at forsøgene måtte afsluttes, da de valgte koncentrationer tilsyneladende var for høje til, at en test af 21 dages varighed kunne gennemføres. Beregning af PE_t -IT₅₀-værdier for eksponeringen for 1 μg/l og 5 μg/l viser ligesom de indledende tests med 20 μg/l og 30 μg/l en lille forbedring i mobiliteten i løbet af de første 24 timer efterfulgt af et fald fra tiden t = 24 til t = 48 timer (Bilag 6.1.4), hvilket afspejles ved en stigende PE_t-IT₅₀-værdi fra tiden t =0 til tiden t = 24 timer, der så igen falder til tiden 48 timer. Kun værdierne for 5 μg/l adskiller sig fra værdierne for 20 μg/l og 30 μg/l (på nær til tiden t = 24t for 30 μg/l). Der kunne ikke konstateres sammenhæng mellem koncentration og PE_t-IT₅₀-værdien.

Nørum & Bjerregaard (2003) testede effekten af pyrethroiderne esfenvalerat og cypermethrin på mobiliteten hos Gammarus pulex og Asellus aquaticus. De så at immobilisering indtraf tidligere og tidligere ved eksponeringen af Gammarus pulex for koncentrationer der var ≥1 μg/l og Asellus aquaticus for koncentrationer ≥0,3 μg/l. Tilsvarende fandt Cold & Forbes (2004) en markant stigning i dødeligheden hos Gammarus pulex efter overførslen til rent vand, selv om der var 100% overlevelse umiddelbart efter pulseksponeringer for esfenvalerat på op til 2 μg/l. I vore forsøg blev set en lille stigning i mobiliteten (Tabel 5) efter overførslen til rent vand fra en eksponeringskoncentration, der var over en faktor 10 højere end koncentrationen Cold & Forbes anvendte. Vi fandt dog ingen markant dødelighed efter 48 timer i rent vand (pulstest med 20 μg/l og 30 μg/l samt kontinuerte tests med 1 μg/l, 5 μg/l og 20 μg/l). Dette rejser spørgsmålet, om stoffet har været til stede i mediet i de valgte koncentrationer under pulstestene eller om f.eks. adsorption til testbeholderne har reduceret den reelle eksponeringskoncentration. Af økonomiske årsager har det ikke har været muligt at foretage kemiske analyser i de udførte test, men tages esfenvalerats fysisk-kemiske data i betragtning (især den høje K_ow-værdi) er sorption til glasvægge en realistisk fjernelsesproces (jf. afsnit 2.3). I den anvendte testprocedure defineres graden af immobilitet ikke, og der skelnes derfor ikke mellem dyr, der har en nedsat  bevægelse sammenlignet med kontrollen og dyr der tydeligvis er ved at dø. Som indikeret af reproduktionstestene er det derfor muligt, at dyrene eksponeret for 20 μg/l og 30 μg/l ville have udvist en markant større dødelighed, hvis posteksponeringsperioden var blevet udvidet i forhold til de 48 timer. Endelig skal det nævnes, at forskellen mellem de her beskrevene tests med Daphnia magna og forsøgene udført af Nørum & Bjerregaard (2003) & Cold & Forbes (2004) med Gammarus pulex og Asellus aquaticus kan skyldes, at arterne har forskellig følsomhed overfor stoffet (jf. f.eks. Stephenson, 1982; Nørum & Bjerregaard 2003).

Gentagne pulseksponeringer med esfenvalerat viste større effekt på mobiliteten hos dafnier end en enkelt puls (t = 0 timer). Ligeledes kunne markante effekter ses ved lavere eksponeringstider end efter en enkelt puls. Efter 24 timers observation er den samlede effekt stort set uændret. Èn markant forskel er dog ændringen i andelen af dyr, der går fra immobilisering til død. Ud fra resultaterne nævnt i overstående, kan vi imidlertid ikke udelukke, at vi ville have set en tilsvarende effekt med tiden hvis observationsperioden, efter den første puls (pulstest med 20 μg/l og 30μg/l), var blevet udvidet.

Som tidligere nævnt var der generelt stor dødelighed under tests for kroniske effekter af esfenvalerat, og flere test blev stoppet inden udløbet af de 21 dage p.g.a. for stor dødelighed (Bilag 6.1.4). Testen med en pulseksponering på 0,1 μg/l, var den eneste test der forløb over alle 21 dage, og selv i denne test blev OECD-standardens krav om maksimal 20% døde i kontrolgruppen ikke opfyldt (Bilag 6). På baggrund af resultater opnået med de overlevende moderdyr, kan det dog konkluderes, at der ikke blev fundet effekter på antallet unger, størrelse eller vægt efter 21 dage, men det skal understreges, at der kræves yderligere undersøgelser inden endegyldige konklusioner vil kunne drages. I test med kontinuert eksponering er NOEC fundet til 0,052 μg/l for 21-d testen med Daphnia magna (Tabel 1). Kroniske effekter af pulseksponeringer for esfenvalerat er tidligere blevet fundet ved test med krebsdyr. Cold & Forbes (2004) eksponerede Gammarus pulex indenfor koncentrationsintervallet 0,1-0,6 μg/l (1 time), og så effekter på overlevelse, pardannelse og reproduktion. Disse effekter kunne ses mindst to uger efter pulsens ophør. Barry et al. (1995) undersøgte effekten af pulseksponeringer for esfenvalerat på regnbuefisken Melanotaenia fluviatilis, og fandt en negativ korrelation mellem koncentration og fekunditet og det totale antal yngel.

5.2.5 Pyrazophos

Baseret på en IC_50,24t-værdi på 0,62 μg/l opnået i ISO-test med kontinuert eksponering blev pyrazophos fundet at være det mest toksiske af alle testede stoffer. I Tabel 1 er opgive en værdi på 0,36 μg/l, som ligger inden for 95%’s konfidensintervallet for de opnåede resultater i dette projekt

I pulstest med immobilisering som endpoint udviste pyrazophos en forsinket negativ respons fra tiden t = 0 timer til tiden t = 24 timer efter eksponeringer for 10 μg/l eller 20 μg/l. Den grafiske fremstilling viser også tendenser til forsinkede negative effekter ved koncentrationerne 2,5 μg/l, 5 μg/l og 7,5 μg/l. Generelt blev der kun set effekter efter eksponeringer for pulse af 2-6 timers varighed, men i løbet af posteksponeringperioden ses det, at mobiliteten forringes hos dafnier, der har modtaget korterevarende pulse. Der er derfor også tale om en effekt på længere sigt hos grupper, der ikke udviste respons umiddelbart efter eksponeringens ophør.

Udsættes dyrene for endnu en puls af samme koncentration og varighed forøges responset betydeligt også i grupper, der ikke blev påvirket af den indledende puls (1-2t). Ligeledes stiger responset med tiden, og efter 48 timer skyldes størsteparten af responset dødelighed. Key & Fulton (1993) viste, at gentagne pulse af chlorpyrifos, der ligesom pyrazophos er en acetylcholinesterasehæmmer, øger toksiteten af pesticidet. Tilsvarende undersøgte Naddy & Klaine (2001) effekten af gentagne chlorpyrifos-eksponeringer, og fandt, at gentagne pulse er mere toksiske end en enkelt puls. Naddy & Klaine (2001) fandt for chlorpyrifos, at dyrene genvandt mobiliteten mellem to pulse, hvilket er et andet mønster end hvad vi observerede for pyrazophos, til trods for at de pesticider formodes at have samme virkningsmåde på Daphnia magna.

5.2.6 Azoxystrobin

De fundne IC₅₀-værdier for 24 og 48 timer for azoxystrobin stemmer godt overens med værdierne fundet af Lauridsen et al. (2003) ligesom der også er en rimelig overensstemmelse med værdierne angivet i Tabel 1. Pulseksponeringer for azoxystrobin (10,5-12,5 μg/l) viste kun en effekt ved pulse af 4-6 timers varighed. De beregnede PE_t-IT₅₀-værdier viste hverken tegn på restituering eller en forsinket negativ effekt efter pulseksponeringer for azoxystrobin i løbet af den undersøgte observationsperiode. Dog er effekten af eksponeringen hovedsagelig i form af dødelighed. Vi ser derfor at de dyr, der har kunnet klare eksponeringen for azoxystrobin, ikke får en forsinket effekt, hvorimod dyrene, der har været mere sensitive dør straks. Som omtalt i afsnit 2.2.5 virker azoxystrobin ved at hæmme den mitrochondrielle respiration, hvorved energidannelsen i cellen hæmmes og organismen dør. Dette er ligeledes i overenstemmelse med de her opnåede resultater.

Nørum & Bjerregaard (2003) undersøgte effekten af pulseksponeringer med azoxystrobin på bevægelsesadfæren hos Gammarus pulex. Under eksponeringen af dyrene for en azoxystrobin-koncentration på 100 μg/l blev der ikke observeret nogen adfærdsændringer. Adfærdsforsøg udført af Lauridsen et al. (2003) viste, at aktiviteten af hjerte, brystlemmer og mandibler hos ægbærende Daphnia magna (8 ± 1 dag) blev reduceret ved azoxystrobinkoncentrationer på 0,5 mg/l (24 timers eksponering). Tilsvarende blev svømmeaktiviteten reduceret med ca. 15% efter eksponering for 1,0 mg/l. Hverken Nørum & Bjerregaard (2003) eller Lauridsen et al. (2003) har undersøgt restituering efter pesticideksponeringerne.

5.2.7 Diquat

IC_50,24t-værdien for diquat blev fundet til 23,9 μg/l, hvilket er klart lavere end værdien opgivet i Tabel 1. Det var ikke muligt at beregne en tilsvarende værdi for 48 timer, da der var 100% respons i alle grupper på nær den laveste testkoncentration. Ud fra de beregnede PE_t-IT₅₀-værdier alene er det svært at drage entydige konklusioner. Værdierne peger dog i retning af en forsinket negativ effekt. Dette underbygges af den grafiske fremstilling (46-64 μg/l), der viser en markant forsinket effekt i grupper, der har modtaget en puls af 6 timers varighed, hvor vi efter endt eksponering allerede har en effekt på henholdsvis 30%, 80% og 75% (immobilitet) og hvor responset når op på 100% (immobilitet og dødelighed) efter 48 timer. Ligeledes ses der en effekt efter 48 timer i grupper, der har modtaget en puls af 2-4 timers varighed. Der er ikke fundet tilsvarende undersøgelser med diquat i litteraturen, men det skal understreges, at de ovenfor beskrevne effekter optræder ved koncentrationer, der ligger en faktor 5-10 under de effektkoncentrationer (både akutte og kroniske), der opgivet i litteraturen for test med kontinuert eksponering (se Tabel 1).

5.2.8 Bromoxynil

Ved vore test med kontinuert eksponering er bromoxynil fundet at være lidt mindre akut toksisk end opgivet i litteraturen (IC_50,24t =18,9 mg/l mod IC_50,24t=12,5 mg/l opgivet i Tabel 1), men værdier er i samme størrelsesorden.

Pulsforsøg udført med bromoxynil viser et recovery efter eksponeringen for 26 mg/l, hvis vurderingen udelukkende baseres på de fundne PE_t-IT₅₀-værdier (Tabel 8). Figur 18 viser imidlertid også, at der i løbet af de 48 timer efter eksponeringens ophør, sker et skift således, at dyr, der initielt er immobile, dør, i gruppen eksponeret for en 6-timers puls. Om dette skift skal kaldes en forsinket negativ respons kan diskuteres, da immobilisering sandsynligvis også ville gøre, at dyrene ikke er funktionsdygtige i vandmiljøet. På den anden side set bør letale effekter beskrives som forsinkede negative effekter, da restitution – i sagens natur – ikke længere er mulig. Resultaterne tyder derfor på, at der ved pulse af bromoxynil af kortere varighed end 6 timer er tale restitution, mens længerevarende pulse fører til forsinkede negative effekter. Buhl et al.(1993) viste, at Daphnia magna, der var blevet immobiliserede af eksponering for op til 13 mg/l bromoxynil octanoate, kunne genvinde deres mobilitet i løbet af 24 timer, hvis eksponeringen var af 1,5-6 timers varighed. Enkelte af dyrene, der fik en eksponering af 6 timers varighed og 7,8-13 mg/l i disse forsøg var immobile efter 48 timer, og disse resultater er altså samstemmede med, hvad der blev fundet i vore undersøgelser.

Dyr udsat for pulse af bromoxynil på 20 mg/l af 0,5-6 timer varighed viste ikke tegn på skader på reproduktionen, mens der for test med kontinuert eksponering er rapporteret en NOEC efter 21 dage på 3,1 mg/l (se Tabel 1).

5.2.9 4-nitrophenol og 3,5-dichlorophenol

Baseret på PE_t-IT₅₀-værdierne fundet ved pulstest ses det, at dafnier udsat for 4-nitrophenol genvandt mobiliteten efter pulseksponering. Restitutionen er kun tydelig mellem tiderne t = 0 timer og t = 24 timer og bliver mindre udpræget ved stigende koncentrationer. Responset for 4-nitrophenol ændres dog fra immobilitet (t = 0) til dødelighed med tiden (t = 48 t), hvilket også blev fundet efter eksponeringerne for bromoxynil.

For 3,5-dichlorophenol ses tydeligt, at dyrene genvandt mobiliteten efter overførsel til rent vand. Dette gælder for alle testede koncentrationer på nær for den højeste koncentration (3,3 mg/l), hvor det ikke var muligt, at beregne en PE_t-IT50-værdi til tiden t = 0 timer. Igen sker restitutionen mellem tiderne t = 0 timer og t = 24 timer efter pulsens ophør.

5.3 Perspektiver og anbefalinger i relation til risikovurdering og godkendelse af pesticider

5.3.1 Effekter af pulseksponeringer – et nyt internationalt forskningsområde

Stadigt flere artikler i den videnskabelige litteratur diskuterer problemstillingen omkring vurderingen af episodiske pulseksponeringer i det akvatiske miljø, hvor koncentrationen af et eller flere stoffer stiger til et højt niveau i en kortere tidsperiode (Reinert et al., 2002). Spørgsmålet er, hvor stor betydning disse eksponeringer skal tildeles, og om viden fra eksisterende toksicitetstest kan anvendes, når effekten af episodiske eksponeringer skal vurderes. De undersøgelser, der er publiceret i de seneste år har ofte udgangspunkt i, at eksisterende toksicitetstest ikke er tilstrækkelige til vurdering af effekter af pulseksponering, da disse test udelukkende udføres med kontinuerte eksponeringer og ikke tager højde for at eksponeringen i miljøet ikke nødvendig vis er kontinuert (Brent & Herricks, 1999; Naddy & Klaine, 2001). I nogle få af undersøgelserne på akvatiske organismer er der blevet set på langtidseffekter af kortvarigt høje eksponeringer, d.v.s. der er blevet indbygget en observationsperiode, hvor det er blevet testet om dyrene får det bedre eller værre med tiden. Varigheden af disse post-eksponeringsperioder med observation afhænger typisk af den anvendte testorganisme. Inddragelsen af sådanne observationsperiode har, som også vist i nærværende undersøgelse, medført, at effekter, der ikke umiddelbart er synlige efter eksponeringens ophør, er blevet detekteret (Naddy et al. 2000). Ligeledes er der blevet set på kroniske effekter og reproduktionsparametre efter eksponeringen for en puls af et kemikalie (Brent & Herricks, 1999; Schultz & Liess, 2000; Cold & Forbes, 2004; Andersen et al., 2005).

5.3.2 Pulsvarighed og - koncentration

Som nævnt i indledningen har nærværende projekt i højere grad fokuseret på effekterne af pulsvarighed end på effekter af koncentrationer. Dermed har det været ønskeligt, at de anvendte eksponeringstider også har relevans i forhold til eksponeringssituationen i danske vandløb og søer. At bestemme realistiske pulsvarigheder er imidlertid vanskeliggjort af, at kun ganske få undersøgelser af pulshændelser er beskrevet i litteraturen, men også af, at pesticidernes afstrømningsmønstre afhænger af såvel stoffernes fysisk-kemsike egenskaber som deres anvendelse. Ud fra de pulsvarigheder, der er trods alt er beskrevet i litteraturen, er pulsvarighederne anvendt i nærværende projekt i en størrelseorden, der kan være realistisk for danske forhold. Styczen et al. (2003) fandt således pulse af pesticider fra 4-6 timers og op til få dages varighed i vandløb efter regnvejrshændelser, og Slothuus et al. (2004) så pulse af ca. 3 timers varighed efter brugen af blåsten i dambrug. Situationen i søer og vandhuller ser imidlertid anderledes ud, da det typisk vil tage nogle dage fra pesticidet tilføres og til det er jævnt fordelt. I undersøgelsen af Styczen et al. (2003) blev det fundet, at der herefter gik omkring 2 uger inden stoffet igen var ”forsvundet”.

Som tidligere beskrevet er der i vandløb i Fyns, Århus og Nordjyllands Amt fundet pulskoncentrationer af pesticider mellem 0,01 μg/l og 10,0 μg/l (Styczen et al.,2003; Lauridsen & Wiggers 2001). Ikke alle de pesticider, der er anvendt i nærværende projekt, er fundet i ovennævnte undersøgelser. Blandt de fundne stoffer er dog dimethoat, pirimicarb, esfenvalerat og bromxynil, og for disse stoffer gælder det, at de fundet i lavere koncentrationer end anvendt i denne rapport (se afsnit 2.1).

For nogle pesticider er det muligt, at pulse af kortere varighed (0,5-1 time) vil kunne udløse tilsvarende effekter som længerevarende eksponeringer for lavere koncentrationer. Ud fra de opnåede erfaringer i nærværende projekt var det dog kun i få tilfælde muligt at påvise effekter af pulsvarigheder <1 time. Ved fremtidig anvendelse af pulstest kan eksponeringen ved 0,5 time med rimelighed undlades.

Især effekter af længerevarende pulse (flere timers varighed) påkalde sig opmærksomhed i forbindelse med godkendelse og risikovurderinger pesticider. Afhængigt af pesticidernes fysisk-kemiske egenskaber og anvendelsesmønstre vil der kunne forekomme ganske høje koncentrationer i recipienterne. Dette understøttes af modelberegninger foretaget med PestSurf, som simulerer eksponering i vandløb i hhv. et sandet og et leret opland, som belastes med pesticider (Styczen & Poulsen, 2005). Med undtagelse af bromoxynil er disse modelkørsler er ikke foretaget for de stoffer, som indgår i nærværede undersøgelse. I det følgende vil resultater af disse modelkørsler for bromoxynil, alpha-cypermethrin og tribenuron-methyl kort blive omtalt. For data vedr. bromoxynil henvises til Tabel 1. Alpha-cypermethrin er et lipofilt stof (logKow = 5.5), har en høj sorption (Koc = 57889) og en relativ lang halveringstid (DT50=103 d) (Styczen & Poulsen, 2005). I modsætning hertil er tribenuron-methyl hydrofilt (logKow=0.78), er mobilt (Koc = 22) og har en kort halveringstid (DT50= 9 d). (Styczen & Poulsen, 2005). Udover at disse to stoffer dækker et stort spektrum af fysisk-kemiske egenskaber, kan disse to stoffers opførsel i miljøet med rimelighed sammenlignes med hhv. esfenvalerat’s og dimethoat’s skæbne i miljøet, når stoffernes fysisk-kemiske data tages i betragtning.

Tabel 17. Maksimumskoncentration i vandløb med hhv. leret og sandet opland beregnet i PestSurf samt anvendt dosering ved modelberegninger (Styczen & Poulsen, 2005). Sammenligneligt stof med tilhørende normal dosering er vist i sidste kolonne.

¹Maksimumskoncentration beregnet i et tidsrum på 24 timer.

I Tabel 17 er vist resultater fra PestSurf-modellen i form af koncentrationer i vandløb med hhv. leret og sandet opland med den angivne dosering. For bromoxynil er resultaterne naturligvis direkte anvendelige, for alpha-cypermethrin er den anvendte dosering i overensstemmelse med normal doseringen af esfenvalerat, mens der for tribenuron-methyl er regnet på en dosering, der er 20 gange mindre end normaldoseringen af dimethoat.

Herbicidet bromoxynil findes således i koncentrationer, der er mere end 10⁶ gange lavere end de koncentrationer, der er undersøgt i pulstestene, og pulseksponering af krebsdyr med bromoxynil forventes derfor ikke at give anledning til effekter på mobiliteten af krebsdyr i vandmiljøet.

For insekticiderne dimethoat og esfenvalerat var det overordnede billede efter pulstest, at dyrene genvandt mobiliteten, men for eksponeringer af 6 timers varighed med 20 mg/l dimethoat var 40% af dyrene immobile (Figur 21) og 90% immobile efter eksponering for 20 μg/l esfenvalerat (Figur 14). De anvendte koncentrationer ved pulstestene er i størrelsesordenen 10⁴ højere end de i Tabel 17 angivne (efter korrektion for dosering af dimethoat). Dette vil normalt blive betragtet som en tilfredsstillende sikkerhedsmargin (margin of saftety, MOS). I denne forbindelse skal observationstiden efter pulseksponeringen i dafnietestene dog inddrages (se afsnit 5.3.3) ligesom også resultater opnået ved forsøg med gentagne pulse bør tillægges stor vægt. Ved disse forsøg blev genvinding af mobiliteten ikke set ved overførsel til rent vand efter anden puls, og der var en udpræget tendens til øget dødelighed i grupper udsat for pulseeksponeringer af mere end 2 timers varighed. Dette mønster blev set for såvel dimethoat (Figur 21) og esfenvalerat (Figur 23). At gentagne pulse forekommer, er også illustreret modelberegninger gennemført i PestSurf af Styczen & Poulsen (2005), men ”pulsadfærden” af et stof afhænger mange parametre såsom oplandets karakteristika, regnhændelsernes varighed og intensitet og stoffernes fysisk-kemiske egenskaber. Det ligger udenfor dette projekts rammer at beskrive disse sammenhænge, men de opnåede resultater understreger, at gentagne pulseksponeringer vil have en markant større effekt end de enkelt-stående pulse. Den ovenfor angivne sikkerhedsmargin for dimethoat og esfenvalerat vil derfor blive mindre, hvis gentagne pulse tages i betragtning. Der mangler dog yderligere undersøgelser af effekten af gentagne pulse for kunne kvantificere, hvor meget sikkerhedsmarginen reduceres.

5.3.3 Observationstid efter pulseksponering

Ved vurdering af forsinkede effekter efter pulseksponeringens ophør er det dog nødvendigt at evaluere de anvendte observationstider. I de her udførte test er anvendt en observationsperiode på 48 timer i forbindelse med vurdering af kortidseffekter. For mest lipofile stoffer (esfenvalerat og chlorpyrifos) kan længden af observationsperioden have været for kort til at se evt. forsinkede effekter af pulseksponeringen. Yderligere undersøgelser med fokus på relationer mellem fysisk-kemiske stofegenskaber og effekter af pulseksponering er derfor påkrævede (se også afsnit 5.3.2). I den forbindelse vil det være et krav, at de biologiske observationer følges med koncentrationsmålinger. De stoffer, for hvilke observationsperiodens længde er af afgørende betydning, er nemlig også er de stoffer, som er de vanskeligste at håndtere i laboratoriet (pga. høj fedtopløselighed og stor sorption til alle overflader). I den forbindelse kan anvendelsen af radioaktive isotoper være særdeles fordelagtig, da en komplet redegørelses for stoffernes opførsel før, under og efter eksponering er ønskelig.

5.3.4 Risiko for effekter som følge af pulseksponering

I forbindelse med vurdering af de anvendte koncentrationers ”miljørealisme”, skal det understreges, at testudviklingen og den gennemførte testning i nærværende projekt har været rettet mod regulatorisk anvendelse af resultater fra toksicitetstest snarere end simulering af miljørealistiske koncentrationer. Som ved den øvrige regulatoriske testning anvendt ved risikovurdering af kemiske stoffer (standardtest) er formålet med nærværende undersøgelser ikke i sig selv at beskytte dafnier under naturlige forhold. Formålet med standardtest er at levere data, der kan bruges ved vurdering af, hvordan økosystemets arter og dets struktur kan beskyttes. I denne sammenhæng anvendes dafnier som testorganismer ud fra de (overvejende praktiske) hensyn, der er beskrevet i afsnit 2.4. Ved den videre anvendelse af resultater opnået ved pulstest med såvel akutte som kroniske endpoints skal data derfor kunne passes ind i den nugældende risikovurderingspraksis. Dette vil typisk indebære, at der anvendes sikkerhedsfaktorer (også kaldet usikkerhedsfaktorer eller applikationsfaktorer) for at ekstrapolere fra de anvendte laboratorietest og testorganismer til vandmiljøet og dets fauna. Disse sikkerhedsfaktorer kan være i størrelsesordenen 10-1000 i henhold til nationale vurderingsrammer og harmoniserede principper i pesticiddirektivet. Tages dette forhold i betragtning, vil flere af de anvendte eksponeringskoncentrationer ligge inden for, hvad der kan betragtes som miljørealistiske koncentrationer i pulse.

Hvorvidt anvendelse af de værdier, der fremkommer ved standardtest med kontinuert eksponering, er tilstrækkeligt til at beskytte krebsdyr i vandmiljøet mod effekter af pulseksponeringer, er stadig et åbent spørgsmål. Ved sammenligning mellem de anvendte puls koncentrationer og effektkoncentrationer opnået ved standardtest vil sidstnævnte ligge klart lavest. Hermed er det nærliggende at konkludere, at anvendelse af data fra test med kontinuert eksponering vil være det mest konservative mht. at beskytte mod effekter i vandmiljøet. I den forbindelse skal det dog understreges, at de otte pesticider og to referencestoffer, der indgik i nærværende undersøgelse, udviste forskellige responsmønstre, som ikke umiddelbart kan relateres til stoffernes virkemekanismer. Desuden har undersøgelsens fokus, af økonomiske årsager, ligget på effekten af eksponeringens varighed. Dette forhold begrænser mulighederne for at konkludere mere håndfast på effekter af varierende koncentrationer. Derfor er det vanskeligt på baggrund af nærværende undersøgelser at konkludere om fx. PNEC-værdier (predicted no-effect concentration) fastsat på baggrund af standard test (med kontinuert eksponering) er over- eller underbeskyttende i forbindelse vurdering af pulspåvirkninger af vandmiljøet.

Et meget væsentligt nyt resultat af undersøgelserne er dog, at det ikke er korrekt at antage, at der kun kan forventes akutte virkninger af pulseksponeringer. Kroniske effekter blev konstateret i pulstest med to af de undersøgte pesticider (dimethoat og pirimicarb) – endda ved pulse af kun 3 timers varighed. Hermed tilvejebringer pulstestene ny information, der ikke opnås ved de traditionelt anvendte standardtest.

5.3.5 Godkendelse og pulseksponering

Undersøgelsen viser desuden, at der efter eksponeringens ophør kan indtræde forsinkede negative effekter, hvor dyrene enten mister deres mobilitet eller dør, men også at der kan forekomme restitution med tiden. Dette er af stor betydning for godkendelse og risikovurdering af pesticider, såfremt man ønsker at inddrage effekter af pulseksponeringer. Umiddelbart vil man måske vurdere pulseksponeringer, som mindre problematiske end kontinuerte eksponeringer, idet organismernes eksponering i sagens natur er af kortere varighed. For de pesticider, der udviser forsinkede negative effekter efter en pulseksponering, er det forfatternes holdning, at det ikke vil være forsvarligt alene at anvende den korte varighed af pulseksponeringen som argument for at lempe på farlighedsvurderinger af pesticiderne. Dyrene er jo blevet svækket så meget af den kortvarigt høje eksponering, at effekter på mobiliteten indtræder selvom dyrene overføres til rent vand, fodres og får optimale livsbetingelser. Ud fra de gennemførte undersøgelser med pesticider, hvor genvinding af mobiliteten blev påvist efter overførsel til rent vand, er det ikke forsvarligt, på nuværende tidspunkt, at lade pulseksponeringernse korte varighed indgå som argumentation for at lempe på farlighedsvurderinger af pesticider.

5.3.6 Gentagne pulse

De pesticider, hvor pulsforsøg har vist, at eksponerede organismer kommer sig efter eksponeringen, kunne muligvis blive anset som mindre problematiske, hvis det vurderes, at eksponeringer hovedsagelig sker i form af pulse. Dette kunne gælde selv for stoffer, som har høj toksicitet vurderet på baggrund af standardtest med kontinuert eksponering (fx. pirimicarb og pyrazophos). Genvinding af mobiliteten efter pulseksponeringens ophør blev vist for seks af de undersøgte pesticider, men for to af disse seks blev der efterfølgende set alvorlige effekter på reproduktionen. For disse stoffer (dimethoat og pirimicarb) er det altså tydeligt, at den ”tilsyneladende restitution” (genvinding af mobilitet efter 24-48 timer i rent vand) dækker over, at dyrene er blevet så svækkede af pulseksponeringen, at det senere får betydning for reproduktionen. Den ”tilsyneladende restitution” kom også til udtryk ved de udførte forsøg med gentagne pulse af dimethoat, pirimicarb, pyrazophos og esfenvalerat. For tre af de fire stoffer havde den gentagne pulseksponering en effekt, der var mere markant end effekten af den indledende puls også selv om der sås et recovery i løbet af de 48 timer, der fulgte efter den indledende puls.

Effekter som følge af gentagen pulseeksponering er et område, hvor manglen på viden er åbenlys, selvom der næppe hersker tvivl om, at netop er gentagen pulseksponering er meget sandsynlig i vandmiljøet.Vi står derfor overfor følgende spørgsmål, som yderligere test sandsynligvis ville kunne belyse: 1) I hvilken grad kommer dyrene sig efter den indledende eksponering? 2) Kunne effekten af eksponeringen være opstået uden den gentagne puls f.eks. som følge af en aldersbetinget følsomhed? 3) Ville samme mønster blive observeret, hvis intervallet mellem pulsene var blevet udvidet? På baggrund af nærværende projekt er anbefalingen derfor, at der igangsættes videregående undersøgelser af indflydelsen af gentagne pulseksponeringer med pesticider.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 August 2006, © Miljøstyrelsen.