Miljøprojekt, 1135 – Påvisning af patogene bakterier i vand ved anvendelse af DNA-chip-prototype og mikrobiologiske dyrkningsmetoder

Påvisning af patogene bakterier i vand ved anvendelse af DNA-chip-prototype og mikrobiologiske dyrkningsmetoder

7 Konklusion

I denne undersøgelse er testet en ny hurtiganalyse (DNA-chip-metoden) til påvisning af 5 patogene bakterier (Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila og Salmonella spp.), som kan være årsag til vandbårne sygdomsudbrud samt forekomme i vandmiljøer som drikkevand og badevand. Analysetiden for DNA-chip-metoden er 1 døgn (inklusiv identifikation af organismerne), hvilket skal sammenlignes med de tilsvarende analyse- og verifikationstider på mellem 2-12 døgn for de mikrobiologiske dyrkningsanalyser.

DNA-chip-prototypen har været igennem mange kontrolforsøg inden opstart af dette projekt. Kontrolforsøgene viste, at enkelte DNA-prober på chippen ikke fungerer optimalt – disse prober er udeladt i dette projekt og vil blive udskiftet ved næste revision af prototypen.

Til gengæld var der ikke udviklet en færdig prøveforberedelsesprocedure til DNA-chip-metoden til analyse af vandprøver inden projektstart, og et sådant udviklingsarbejde lå ikke inden for rammerne af dette projekt. Det blev derfor besluttet at inddrage analyse af suspensionsprøver (=opslemninger af mikroorganismer) i projektet, fordi DNA-chip-analyse af disse prøver ikke ville kræve prøveforberedelse (opkoncentrering). Ved forsøgsstart viste det sig, at start-kulturen af Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila og Legionella pneumophila ikke var vokset op til den forventede celletæthed, hvilket gav mangel på materiale i forsøget. Som resultat heraf var det ikke muligt at gennemføre DNA-chip-analyse direkte på suspensionsprøver uden prøveforberedelse (se forklaring i afsnit 5.1), og et ekstra opkoncentreringstrin (centrifugering) af suspensionsprøverne blev inkluderet. Dette ekstra opkoncentreringstrin vil betyde et tab af materiale i forsøget (primært for Campylobacter, som er vanskelige at spinde ned), og dermed blev DNA-chip-metodens følsomhed reduceret i forhold til de mikrobiologiske dyrkningsmetoder.

Til prøveforbehandling af spikede vandprøver blev der i projektet valgt en procedure med direkte anvendelse af filtermaterialet i PCR. Fordelen ved denne metode er, at den er hurtig og effektiv over for mange forskellige typer af bakterier. Ulempen er, at proceduren giver mere end en 10x faktors forringelse af DNA-chip-analysens følsomhed ved analyse af de spikede vandprøver, hvilket tydeligt fremgår af resultaterne (generelt lavere signal-værdier for disse analyser sammenlignet med de tilsvarende suspensionsprøver).

Konklusionen på de mikrobiologiske analyseresultater er, at dyrkningsmetoderne generelt genfinder de forventede patogene bakterier i blanding A, C og A+C for både suspensionsprøver og spikede vandprøver indeholdende hhv. 10⁸, 10⁶, 10⁴ og 10² celler pr. prøve. Med DNA-chip-prototypen opnås de forventede (korrekte) signaler for alle patogene bakterier i prøver bestående af 10⁸og 10⁶ celler pr. patogen pr. prøve.

DNA-chip-metoden kan i dens nuværende design og assay-format ikke detektere specifikke bakterier ned til 10² celler pr. prøve, men i nogle tilfælde var det muligt at detektere 10⁴ specifikke bakterier, jf. tabel 4 (og de ovenfor nævnte forbehold for prøveforbehandling). Signaler for positive kontrolprober fås fra alle prøver (også 10²-prøverne) i DNA-chip-analysen, jf. tabel 5.

Generelt er der overensstemmelse imellem resultaterne opnået med DNA-chip-prototypen og de almindelige dyrkningsmetoder for bakterieblandingerne A, C og A+C indeholdende 10⁸ og 10⁶ celler pr. prøve.

Ud fra resultaterne, opnået i dette projekt, er der behov for følgende:

DNA-chip-metodens følsomhed skal forbedres, hvis metoden skal anvendes til analyse af patogene bakterier i vand. Optimering af DNA-chip-metodens følsomhed kan gennemføres ved at;
- optimere på selve DNA-chip-assayet (ved at forbedre på mærkningsreaktionen og/eller anvende enkelt-strengede PCR produkter til DNA-chip-analysen) og ved at
- udvikle en prøveforbehandlingsmetode, der er målrettet til DNA-chip-analyse af mange forskellige patogene bakterier i vandprøver.
Desuden forudsætter anvendelse af DNA-chip-prototypen i praksis, at metoden testes på ”rigtige” vandprøver for at undersøge, hvorvidt forskellige indholdsstoffer (organiske stoffer, metaller etc.) i eksempelvis drikkevand og badevand influerer på analysen.