Miljøprojekt, 1135 – Påvisning af patogene bakterier i vand ved anvendelse af DNA-chip-prototype og mikrobiologiske dyrkningsmetoder

Påvisning af patogene bakterier i vand ved anvendelse af DNA-chip-prototype og mikrobiologiske dyrkningsmetoder

Sammenfatning og konklusioner

Baggrunden for denne indledende undersøgelse er, at Bioneer A/S har udviklet en molekylær hurtigmetode baseret på DNA-chip-teknologi til hurtig og simultan detektion af patogene mikroorganismer. ”Proof-of-concept” for anvendelse af en DNA-chip-prototype til påvisning af patogene bakterier er etableret, og næste skridt er at teste anvendeligheden af et sådant koncept i praksis.

Formålet er at undersøge DNA-chip-metodens potentiale og anvendelighed som en hurtig screeningsanalyse for udvalgte patogene mikroorganismer i vand. I projektet sammenlignes DNA-chip-prototypen i dens nuværende form og design (med de begrænsninger prototypen har på specificitet og følsomhed) med almindelige mikrobiologiske dyrkningsmetoder til påvisning og identifikation af patogene bakterier.

Til undersøgelsen er udvalgt 5 modelorganismer. Mikroorganismerne er valgt med den begrundelse, at de kan være årsag til vandbårne sygdomsudbrud samt at de forekommer i vandmiljøer som drikkevand og i badevand. De nævnte mikroorganismer er Campylobacter jejuni, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila og Salmonella spp.. Det eksperimentelle design og forsøgsplanen til undersøgelsen er delt i 2 parallelle blokke, hvor den første del omhandler direkte detektion af patogene bakterier i suspensionsprøver, mens den anden del af forsøget omhandler detektion af patogener spiket i sterilt vand.

DNA-chip-analysen er baseret på en enzymatisk polymerase kæde-reaktion (PCR) opformering af DNA vha. en såkaldt konsensus 16S rDNA-PCR reaktion med endemærkede, ribosomale primere.

Resultatet af DNA-chip-analyse af suspensionsprøver og spikede vandprøver indeholdende blandinger af test-organismer viste, at der opnås de forventede (korrekte) signaler for alle patogene bakterier i prøver bestående af 10⁸og 10⁶ celler pr. patogen pr. prøve. Konklusionen på de mikrobiologiske analyseresultater er, at dyrkningsmetoderne generelt genfinder de forventede patogene bakterier i både suspensionsprøver og spikede vandprøver indeholdende hhv. 10⁸, 10⁶, 10⁴ og 10² af hver test-bakterie pr. prøve.

Generelt er der overensstemmelse imellem resultaterne opnået med DNA-chip-prototypen og de mikrobiologiske dyrkningsmetoder for bakterieblandingerne indeholdende 10⁸ og 10⁶ celler pr. prøve. DNA-chip-metoden kan i dens nuværende design og assay-format ikke detektere specifikke bakterier ned til 10² celler pr. prøve, men i nogle tilfælde var det muligt at detektere 10⁴ specifikke bakterier. Signaler for positive kontrolprober fås fra alle prøver (også 10²-prøverne) i DNA-chip-analysen.

DNA-chip-metodens følsomhed skal forbedres, hvis metoden skal anvendes til analyse af patogene bakterier i f.eks. drikkevand. Optimering af DNA-chip-metodens følsomhed skal bl.a. gennemføres ved at udvikle en prøve-forbehandlingsmetode, der er målrettet til DNA-analyse af patogene bakterier i vandprøver. I dette projekt var det nødvendigt at anvende en prøveforbehandlingsprocedure, som betød tab af udgangsmateriale, og dermed blev DNA-chip-metodens følsomhed reduceret i forhold til de mikrobiologiske dyrkningsmetoder.