Miljøprojekt, 1062 – Kildeopsporing ved fænotypisk karakterisering af enterokokker

Kildeopsporing ved fænotypisk karakterisering af enterokokker

2 Metodebeskrivelse

Phplate RF er udviklet af PhPlate Microplate Techniques AB, Stockholm. (www.phplate.se). Med metoden bestemmer man Enterokokkers evne til at vokse på 11 relevante substrater. Den anvendte procedure følger anvisningerne fra PhPlate Microplate Techniques AB og er suppleret med oplysninger fra Thor Axel Stenström, Smittsskyddsinstitutet, og Inger Kuhn, Karolisnska Institutet (Pers. com. 2003). Inger Kuhn udviklede metoden sammen med Thor Axel Stenström i starten af 1990erne (Kuhn et al. 1991)

Vandprøver filtreres og dyrkes ved 37°C i 48 timer på m-Enterokok agar. Faste prøver suspenderes i buffer og spredes på m-Enterokok agar. Suspekte kolonier verificeres på galdeæskulin-agar ved 44°C.

I en 12 x 8 brønds mikrotitrebakke er der nedlagt 11 tørrede substrater i hver af de 8 rækker. Ved analysens start tilsættes alle brøndene enterokoksubstrat med bromothymolblå som indikator for vækst. En enterokok-koloni suspenderes i den første brønd uden tørret substrat. Dette gentages for hver af de 8 rækker. Herfra pipetteres suspensionen ud i de andre 11 brønde med en 8 kanalers multipipette. Pladen inkuberes ved 37°C og aflæses på en flatbed-scanner (HP4700) efter 16, 40 og 64 timer. Figur 2.1 viser et eksempel på en plade, der har været inkuberet i 64 timer. De gule brønde er positive. Ved aflæsningen af pladen bestemmes intensiteten af den gule farve.

Figur 2.1 PhPlate RF der har været inkuberet ved 37°C i 64 timer

Resultaterne behandles i et program, phpwin, der er udviklet af Phplate. Programmet kan beregne similaritet mellem isolater, optegne dendogrammer, bestemme similaritet mellem populationer og identificere de mest typiske isolater blandt de fundne fænotyper.