|
Kildeopsporing ved fænotypisk karakterisering af enterokokker 4 Resultater og diskussion
4.1 BadevandskontrolanalyserI forbindelse med denne undersøgelse har Miljøstyrelsen bedt Miljøcenter Vestjylland I/S om at analysere for fækale Enterokokker, foruden de normale parametre, på badevandsstationen Vandet Sø Østende. Resultaterne af disse analyser fremgår af tabel 4.1. Det ses, at koncentrationen af Enterokokker er højere end kravet i Kommissionens forslag til et nyt badevandsdirektiv på 200 pr. 100 ml på 2 ud af de 8 dage, hvor der er udtaget prøve. Det kan også konstateres, at der er en rimelig overensstemmelse mellem antallet af Enterokokker og E. coli, idet de høje værdier måles på de samme dage, undtagen den 19. august hvor koncentrationen af E. coli var lav i forhold til Enterokokker. Beregnet på grundlag af logaritmerede data er forholdet mellem E. coli og Enterokokker 2,4 i denne undersøgelse. Hvis resultaterne fra prøven udtaget den 19. august udelades af beregningerne, er forholdet 3,4. I Kommissionens forslag er faktoren mellem kravene for E. coli og Enterokokker på 2,5. Tabel 4.1 Resultater af analyser af prøver fra Vandet Sø Østende udført af Miljøcenter Vestjylland
4.2 Bestemmelse af Enterokokker i prøver udtaget den 21. august og den 10. september 2003Koncentrationen af Enterokokker i de prøver, der er udtaget i nærværende undersøgelse, fremgår af tabel 4.2. Det foreslåede krav for Enterokokker i Kommissiones forslag til et nyt badevandsdirektiv er overskredet på badevandsstationen på begge prøvetagningsdatoer. Det ses, at koncentrationerne i badevandsprøverne stemmer godt overens med resultaterne opnået af Miljøcenter Vestjylland, hvor der blev fundet en overskridelse den 19. august og en værdi lige på grænsen den 9. september 2003. Koncentrationen af Enterokokker lå ikke uventet væsentligt højere i prøven fra nedsivningsanlægget og i gylle- og gødningsprøverne. Derimod er det overraskende, at samlebrønden fra lejrskolen har så lavt indhold. Vandindholdet i kokasserne varierede betydeligt, men er af praktiske årsager ikke målt, og tallene er derfor ikke direkte sammenlignelige. Kokasserne, der blev udtaget ved pumpekanalen, var friske og våde. Kokasserne fra kvægvandingsarealet var derimod 1 til 2 uger gamle og delvist udtørrede. Kun prøverne fra kvægvandingsområdet og vandet med mågeklatterne lå under kravet på 200 Enterokokker pr. 100 ml. Indholdet af Enterokokker i vandet med mågeklatter er overraskende lavt, da Enterokokker er tilstede i fugleklatter i højt antal. Det betyder, at forurening af prøven med fugleklatter ikke nødvendigvis giver anledning til enkeltstående forhøjede koncentrationer af Enterokokker i forbindelse med badevandsovervågning. Tabel 4.2 Bestemmelse af antal Enterokokker i prøver udtaget den 21. august og 10. september 2003
Figur 4.1 Dendogram, der viser similariteten mellem tre testede kontrolstammer og blindtest 4.3 Fænotypebestemmelse4.3.1 Indledende analyse af kontrolstammer og "blindprøver"Inden analyse af Enterokokker fra badevandsprøverne er der på to forskellige dage gennemført fænotypebestemmelse af tre kontrolstammer. Stammerne er leveret af Inger Kuhn, Karolinska Institutet. Resultaterne ses i figur 4.1. På figuren angiver de lodrette streger, der forbinder de enkelte isolater, niveauet for similaritet. Der ses god overensstemmelse mellem de to dage og inden for dagen. I to blindtest er der dog sket en forurening (angivet med x i figuren). I et tilfælde er stamme GL16 afvigende fra de øvrige (angivet med x). For stamme Erik1 er similariteten mellem de to dage lidt mindre end 0,975, der normalt anses for at være grænsen, hvorover stammerne anses for at være ens (Kuhn et al. 2003). Årsagen er ifølge Inger Kuhn, at stamme Erik1 giver varierende resultater på et af substraterne i pladen. 4.3.2 BlindprøverI forbindelse med analyse af prøverne er der udført i alt 69 blindtest. Af disse blev 21 så forurenede, at der blev observeret vækst i en eller flere af brøndene. I forbindelse med analyserne på prøverne udtaget den 21. august var 44% forurenede, mens der var 19% forurenede i forbindelse med prøverne udtaget den 10. september. Altså en væsentlig forbedring for den anden prøvetagning. Årsagen til forureningerne er ikke kendt, men det forventes, at større rutine og forsigtighed kan nedsætte forureningsgraden. Endvidere kan der muligvis ændres på den praktiske udførelse. Hvis metoden skal videreføres, vil det være fordelagtigt at besøge Inger Kuhn og se, hvordan testen køres der. Den relativt høje forureningsgrad må forventes også at gælde for de testede kolonier. Hvis forureningsgraden kan reduceres, er det sandsynligt, at ID-niveauet også vil kunne hæves, og at analysen bliver mere pålidelig. 4.3.3 DiversitetI tabel 4.3 ses en oversigt over diversiteten (Di) af populationerne på de enkelte lokaliteter. En diversitet på 1 svarer til, at alle isolater er forskellige. En diversitet på 0 svarer til, at alle isolater er ens. Antallet af isolater, der er karakteriseret fra hver prøve, er angivet i tabellen. Der er i alt blevet karakteriseret 238 isolater. Tabellen er ordnet med de største diversiteter øverst i tabellen. De største diversiteter fandtes i badevandsprøverne, bundmateriale ved badevandslokalitet og i prøven fra pumpekanalen, mens de laveste diversiteter blev fundet i prøven fra kvægvandingsområdet, gyllen og ”mågevandet”. I tre af kokasseprøverne blev der også observeret en relativt høj diversitet. Antallet af isolater fra hver af kokasserne er valgt til 8, da man normalt forventer lav diversitet i gødningsprøver (Kuhn et al. 2003). Den høje diversitet viser imidlertid, at det havde været ønskeligt med et højere antal isolater herfra. Tabel 4.3 Antal testede isolater og populationsdiversitet
4.3.4 ID-niveau for similaritetI analyserne af badevandsprøverne er der for alle prøverne medtaget et antal test af de tre kontrolstammer. Endvidere er der lavet dobbeltbestemmelse på mindst 2 af de testede kolonier for hver prøve, og på hver plade er der medtaget mindst en blindtest. På baggrund af disse test kan ID-niveauet, dvs. grænsen for hvor høj similariteten mellem to stammer skal være, før de kan betragtes som ens, bestemmes. Tabel 4.4 viser similariteten for hver af de tre kontrolstammer og similariteten mellem tilfældigt udvalgte kolonier, som er analyseret dobbelt. Den højeste similaritet blev bestemt for de tilfældigt udvalgte og dobbeltbestemte kolonier. Årsagen er formentlig, at dobbeltbestemmelserne alle er foretaget samme dag, mens similariteten mellem kontrolstammerne er bestemt på assays fra 5 forskellige dage. Inden for dagen forventes normalt et ID-niveau på 0,975, mens der mellem dagene forventes at være et ID-niveau på 0,965 (Kuhn et al. 2003). Det betyder, at ID-niveauet for FS1 og dobbeltbestemmelserne er acceptable, mens ID-niveauet for GL16 og Erik1 ikke er acceptabelt. For Erik1's vedkommende vides det, at stammen har en variabel fænotype (se ovenfor). Dette var vi ikke klar over, da stammen blev udvalgt til test af ID-niveau. På baggrund af ovenstående vælges at anvende et ID-niveau på 0,965, da sammenligningerne både foretages på prøver, der er analyseret på forskellige dage og inden for samme dag, og svarende til hvad der som regel anvendes. Tabel 4.4 Similariteten for hver af de tre kontrolstammer og similariteten mellem tilfældigt udvalgte kolonier, som er analyseret dobbelt
4.3.5 Similaritet mellem prøverSimilariteten beregnes som antallet af par med similaritet større end 0,965 divideret med det samlede antal mulige par. For eksempel er similariteten mellem isolaterne i badevandsprøven og prøven udtaget i pumpekanalen den 21. august 0,367. Det betyder, at ud af de 420 (= 20 isolater x 21 isolater) mulige similaritetspar har 36,7% (= 154 par) en similaritet, der er større end 0,965. Sp = 1 betyder, at alle isolater i de to prøver, der sammenlignes, er fænotypisk identiske. Sp = 0 betyder, at ingen af isolaterne i de to prøver har en similaritet over 0,965. I bilag A ses en opgørelse af similariteter mellem isolater (Sp) fra de forskellige prøver. Similariteten mellem prøver bestemmes på baggrund af den parvise similaritet mellem isolater fra de to prøver. Similariteten mellem prøverne kan anskueliggøres ved en statistisk klusteranalyse. Resultatet af en klusteranalyse, hvor kokasseprøverne er samlet som én prøve, er vist i dendogrammet i figur 4.2. Ved klusteranalyser opstår fejl, fordi prøverne ikke sammenlignes parvis men i grupper. Klusteranalysen indikerer, at pumpekanalen eller kokasserne er de af kilderne, der har størst similaritet med badevandsprøverne.
Figur 4.2 Klusteranalyse af resultaterne fra den fænotypiske karakterisering. Tallene i parentes angiver om prøven er udtaget den 21. august (1) eller 10. september (2). Den co-phenetiske korrelation, der er angivet på figuren, er et tal for klusteranalysens pålidelighed. Hvis faktoren er < 0,8 er klusteranalysen upålidelig. Hvis den er 1, er der fuld overensstemmelse mellem dendogrammet og alle de bagvedliggende data. I dette tilfælde er den co-phenetiske korrelation 0,874. Dvs. at klusteranalysens resultater kan anvendes, men at de skal tolkes sammen med de bagvedliggende data (bilag A). Dette er gjort herunder. Similariteten mellem badevandsprøverne udtaget den 21. august og den 10. september lå mellem 0,203 og 0,352, hvilket indikerer, at kilden til forureningen på badevandsstationen sandsynligvis er den samme de to dage. Similariteten mellem de tre badevandsprøver og prøven fra pumpekanalen er høj, idet 35-37% af isolaterne er fænotypisk identiske (Sp=0,351-0,37), og de 4 prøver er grupperet sammen. Som nævnt gik vandstrømmen fra søen og ind i pumpekanalen, således at søen er kilde til forurening i pumpekanalen og ikke omvendt, og similaritet mellem prøverne fra de 2 lokaliteter måtte forventes at være høj. Dette blev bekræftet med kildesporingsmetoden. Derimod er similariteten mellem de øvrige potentielle kilder og badevandsprøverne ikke så entydige, at man kan pege på en forureningskilde med sikkerhed. I bilag A ses det for prøverne udtaget den 21. august, at de eneste potentielle kilder, der har høj similaritet (>0,200) med badevandsprøven, er de to kokasser udtaget ved kvægvandingsområdet (8,9). Som omtalt ovenfor, er antallet af isolater fra hver kokasse lavt i forhold til badevandsprøverne. Derfor er der gennemført similaritetsberegninger, hvor isolaterne fra alle kokasserne er lagt sammen under et. Resultaterne fra denne beregning ses i tabel 4.5. Det ses her, at der herved fås en relativt høj similaritet mellem kokasserne og badevandet, især for prøverne udtaget samme dag (badevand 1 og pumpekanal). Ingen af de andre potentielle kilder viser høj similaritet med badevandsprøverne. Tabel 4.5 Similaritet mellem badevandsprøver og kokasser som samlet prøve
Blandt de analyserede prøver er det derfor kvæget, der med størst sandsynlighed er kilde til forureningen. Mod dette taler dog, at antallet af Enterokokker, der blev fundet umiddelbart tæt på kvægvandingsstedet, var lavt, og fænotypisk var de helt forskellige fra Enterokokkerne i badevandsprøverne. Da der kun er udtaget prøver af kokasser en gang, foreslås det, at der gennemføres en supplerende undersøgelse, hvor der udtages et antal prøver hen over badesæsonen for at bekræfte resultatet. Endvidere at udvalgte isolater bestemmes med en højere opløsning. Det kan være ved hjælp PhPlate RS eller ved genotypning. Kildesporingsmetoden kunne eftervise sammenhængen mellem badevandsstationen og pumpekanalen. Metoden viser imidlertid andre høje, men mindre forklarlige ligheder mellem prøver fra de andre lokaliteter. Den højeste similaritet (0,424) ses mellem prøven fra nedsivningsanlægget (21. august) og prøven udtaget i gylletanken. Den høje similaritet skyldes hovedsageligt, at et isolat fra husspildevandet har en fænotype, der er identisk med fænotypen hos en stor gruppe isolater fra gyllen. Denne sammenhæng kan ikke umiddelbart forklares. Der er også relativt høj similaritet mellem prøver fra lejrskolen og den ene kokasse (Sp=0,25). Samlet set antyder resultaterne, at metoden er behæftet med nogen usikkerhed. En væsentlig grund til denne usikkerhed er sandsynligvis problemet med forureninger af brøndene, og det er vigtigt at disse reduceres, så metodens evne til at skelne mellem prøver forbedres. Endvidere er det vigtigt, at de resultater, der opnås ved metoden, verificeres enten ved at gentage undersøgelsen eller ved at karakterisere isolaterne med mere følsomme metoder, f.eks PhPlate FS og genotypning. Der blev observeret en forholdsvis høj similaritet mellem tre af kokasseprøverne, mens de tre ikke havde fænotyper tilfældes med den fjerde kokasse. Der er kun udtaget 8 kolonier fra hver kokasse. Da diversiteten viste sig at være relativt høj, kan det lave antal isolater være en forklaring på den signifikante forskel. Resultaterne viser imidlertid, at man ikke kan forvente, at Enterokokker fra alt kvæg har samme fænotype. Det var forventet, at der var høj similaritet mellem enterokokpopulationerne i kokasserne udtaget ved kvægvandingsområdet (8, 9), og vandet udtaget umiddelbart i nærheden (3). Dette var ikke tilfældet, idet der i vandet fra kvægvandingsområdet kun fandtes 2 fænotyper, som var forskellige fra alle andre fænotyper. Prøven fra kvægvandingsområdet blev udtaget i en lille lavning med vand, og det kan tænkes, at temperatur- og vækstforhold har været specielt gunstige for enkelte typer af Enterokokker. Korrelationen mellem prøverne fra de 2 prøvetagningsdatoer ved nedsivningsanlægget er lav (Sp = 0,066), hvilket indikerer, at populationerne af Enterokokker i nedsivningsanlægget varierer med tiden.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
