| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Risikovurdering af Giardia og Cryptosporidium i vand

Bilag B

1 Analysemetoder

Parasitære protozoer forekommer som regel i lave koncentrationer i miljøet og lader sig i modsætning til bakterier vanskeligt opkoncentrere til målbare mængder i laboratoriet. (Oo)cyster befinder sig i sedimentet eller suspenderet i vandfasen. Metoder til påvisning er baseret på opkoncentrering af (oo)cyster fra store mængder vand efterfulgt af forskellige teknikker til separation af organismerne fra prøvematerialet, detektion og kvantitering. De fleste teknikker omfatter en eller anden form for mikroskopi. Undersøgelse af viabilitet, bestemmelse af infektivitet ved inokulation i mus eller cellekultur samt artsidentifikation ved molekylær typning kræver i de fleste tilfælde undersøgelse af dobbeltprøver, idet (oo)cysterne går til grunde og DNA'et destrueres under den kvantitative undersøgelse.

Påvisning af protozoer i vand- og miljøprøver er generelt problematisk og de fleste metoder har en meget lav samt variabel genfindelsesprocent. Flere faktorer herunder vandkvalitet og (oo)cysternes alder kan have indflydelse på genfindelsesprocenten, hvilket komplicerer sammenligning af resultater fra forskellige laboratorier. Området er genstand for stor forskningsaktivitet og flere teknikker er under udvikling. I det følgende omtales primært de mest almindeligt anvendte teknikker.

1.1 Koncentration af Cryptosporidium og Giardia fra vandprøver

1.2 Patronfiltrering

Patronfiltrering er den ældste metode til koncentrering af Cryptosporidium og Giardia fra vandprøver. Ved denne metode filtreres 100-1000 l vand, med en flowhastighed på 1-5 l pr. min., gennem et polypropylen-filter med en porrestørrelse på 1 mm. Filteret klippes i mindre stykker, opfanget materiale frigøres ved vask, enten vha. håndkraft eller en stomacher, og koncentreres yderligere ved centrifugering.

Genfindelse (Cryptosporidium): 14-44% (Musical et al., 1987); <1-30% (Ongerth & Stibbs, 1987; Clancy et al., 1994; Shepherd & Wyn-Jones, 1996).

Fordele: forholdsvis enkel metode, relativt billig, kan anvendes til prøver med et højt partikulært indhold.

Ulemper: lav og variabel sensitivitet, filtreringsudstyret er primært anvendeligt på vandværker.

1.2.1 Membranfiltrering

Ved membranfiltrering filtreres vandprøverne (10-40 l) gennem store ”flad-bed” filtre (2 mm polycarbonat membraner eller 1.2 mm cellulose-acetat membraner) (udviklet af Ongerth & Stibbs, 1987). Opfanget materiale skrabes/ vaskes af filtrene og koncentreres yderligere ved centrifugering. En modifikation af denne teknik er under DS godkendelse og har, kombineret med immunomagnetisk separation (IMS) og immunofluorescens antistof detektion (IFA), været anvendt i danske undersøgelser af protozo-forekomsten i drikke- og spildevand (Albrechtsen, 2003; Mølgaard et al., 2002). Lignende teknikker benyttes i USA og UK til lovpligtig undersøgelse af drikkevand for Cryptosporidium og Giardia. I henhold til United States Environmental Protection Agency's metode 1623 undersøges 10 liters vandprøver vha. filtrering under anvendelse af et kapsel filter, IMS og IFA

Genfindelse: 9% for Cryptosporidium, 49% for Giardia (Nieminski et al., 1995). 30-40% samt 50-67% for hhv. Cryptosporidium og Giardia (Shepherd & Wyn-Jones, 1996). Validering af den danske metode viste en gennemsnitlig genfindelse på hhv. 37-39% for Cryptosporidium og 42-53% for Giardia i forkellige rentvandstyper, mens genfindelsen i forskellige typer råvand var 0-3% og 55-62% for hhv. Cryptosporidium og Giardia.

I henhold til EPA's metode 1623 accepteres en gennemsnitlig genfindelse på 13-111% for Cryptosporidium og 15-118% for Giardia. Undersøgelse af prøver fra 87 forskellige vandværker viste en genfindelsesprocent på hhv. 20-60 i vandprøver (N = 279 ~ 65%) tilsat Cryptosporidium og 40-80 i vandprøver (N = 175 ~ 65%) tilsat Giardia (Connell et al., 2000).

Fordele: højere genfindelse end ved patronfiltrering. Filtrering af mindre volumener medfører, at teknikken er lettere at implementere.

Ulemper: dyr metode, variabel sensitivitet, ikke velegnet til vand med høj turbiditet, idet filtrene tilstoppes.

1.3 Flokkulation

Ved tilsætning af kalcium klorid og natrium bikarbonat til vand (10-20 l), samt pH justering til 10 vha. natrium hydroxid, udfældes kalcium karbonat sammen med evt. tilstedeværende (oo)cyster. Efter bundfældning fjernes supernatanten ved afsugning og sedimentet resuspenderes vha. svovlsyre (Vesey et al., 1993b).

Genfindelse: 30-40% for både Cryptosporidium og Giardia; op til 70% i forsøg, hvor der var tilsat friske (oo)cyster til vandprøverne (Vesey et al., 1993b; Campbell et al., 1994; Shepherd & Wyn-Jones, 1996).

Fordele: undersøgelse af lille volumen, simpel teknik, relativ høj genfindelse, billig og anvendelig til vand med høj turbiditet.

Ulemper: påvirker oocysternes viabilitet.

Detektionsgrænsen afhænger bl.a. af hvor stort et volumen, der analyseres. Ved koncentration af mindre volumener undersøges hele koncentratet evt. fra flere enkeltprøver, mens kun en fraktion af koncentratet undersøges efter filtrering af større volumener.

1.4 Separation/oprensning af Cryptosporidium og Giardia fra koncentrerede vandprøver

Koncentrationsteknikkerne tilbageholder alle partikler af en vis størrelse tillige med en række andre partikler fra vandet. Det koncentrerede materiale kan derfor blive meget voluminøst, og partiklerne kan vanskeliggøre påvisning af (oo)cyster ved at dække dem, ved autofluorescens eller ved at interferere med de forskellige detektionsteknikker. Som følge heraf er det derfor nødvendigt at separere (oo)cysterne fra koncentratet vha. én af følgende metoder:

1.4.1 Gradient-centrifugering

(Oo)cyster kan separeres fra forskellige prøvematerialer vha. gradient-centrifugering, idet der anvendes opløsninger af f.eks. sukrose med forskellig densitet. Når (oo)cyster centrifugeres på en sådan gradient, vil de opkoncentreres ved en bestemt densitet, mens de fleste andre partikler bundfældes eller floterer. Sådanne metoder er vidt udbredt til detektion af protozoer i kliniske prøver men ikke særligt velegnede til separation af (oo)cyster fra koncentrerede vandprøver, idet genfindelsesprocenten er lav (>10%) og metoden selektivt opkoncentrerer viable, intakte oocyster (Bukhari & Smith, 1996).

Fordele: billig, kræver ikke særligt udstyr.

Ulempe: beskadigede og døde oocyster påvises ikke, lav genfindelsesprocent.

1.4.2 Immunomagnetisk separation

Magnetiske partikler, overfladebehandlet med specifikke monoklonale antistoffer mod hhv. Cryptosporidium og Giardia, blandes ved denne teknik med suspensioner (koncentrerede vandprøver) indeholdende (oo)cyster. Disse vil herefter bindes til de magnetiske partikler, og således kunne isoleres fra suspensionen vha. en kraftig magnet.

Genfindelse: >90% i rene suspensioner (Campbell et al., 1997).

Fordele: høj genfindelse i rene prøver; lette at aflæse idet indholdet af andre partikler i de oprensede prøver er lavt.

Ulemper: kommercielt tilgængelige kits er ekstremt dyre. Metodens sensitivitet/specificitet afhænger i vid udstrækning af de anvendte antistoffer; såfremt disses affinitet er lav, vil antigen-antistof komplekserne være ustabile og mange (oo)cyster vil ikke blive genfundet. Dette udgør især et problem i prøver med høj turbiditet (råvand/miljøprøver). Bundfaldet i den enkelte prøve bør således ikke overstige 0,5 ml. Kommercielt tilgængelige antistoffer rettet mod oocyst-væggen er ikke specifikke overfor C. parvum, men reagerer også med andre Cryptosporidium arter (McDonald et al, 1991; Graczyk et al., 1996). Tillige er krydsreaktion med gær og alger rapporteret (Rodgers et al., 1995). IMS må derfor nødvendigvis anvendes sammen med en specifik detektionsmetode.

1.4.3 Flow cytometri

Cryptosporidium og Giardia (oo)cyster kan separeres fra miljøprøver vha. et flow-cytometer forsynet med et celle-sorteringsanlæg (Vesey et al., 1993a; 1994). (Oo)cyster i den koncentrerede vandprøve farves med fluorescein isothiocyanat (FITC) mærkede antistoffer og passeres igennem cellesorteringsanlægget (”fluorescence-activated cell sorter = FACS). Partikler med de rette fluorescens og lysbrydningskarakteristika frasorteres og opsamles på et objektglas eller et membranfilter, der aflæses ved flourescens-mikroskopi.

Fordele: som IMS, oprensede prøver er dog ofte renere og tidsforbruget ved aflæsning af prøverne lavere.

Ulemper: kræver dyrt og kompliceret specialudstyr samt personale uddannet til håndtering og vedligeholdelse af apparaturet. Svaghederne ved denne teknik svarer i vid udstrækning til problemerne omtalt i forbindelse med IMS, idet andre organismer, med størrelse og form som (oo)cyster, kan krydsreagere med antistofferne, hvilket nødvendiggør verifikation ved mikroskopi.

1.5 Detektion af Cryptosporidium og Giardia

1.5.1 Immunofluoresens mikroskopi

Påvisning og kvantitering finder sted ved fluorescens mikroskopi af (oo)cyster farvet direkte med FITC-konjugerede monoklonale antistoffer eller indirekte under anvendelse af FITC-konjugerede anti-mus antistoffer. (Oo)cyster identificeres på baggrund af fluorescens, størrelse og form. Positiv identifikation inkluderer på nogle laboratorier desuden påvisning af sporozoiter i (oo)cysterne vha. differential interferens kontrast mikroskopi eller DNA farvning, hvilket medfører højere specificitet.

Fordele: enkel og forholdsvis billig teknik.

Ulemper: kommercielt tilgængelige antistoffer er ikke artsspecifikke, men reagerer med alle arter af Cryptosporidium og Giardia. Idet de fleste arter ikke kan differentieres på baggrund af størrelse og form, giver metoden således ikke mulighed for sikker artsidentifikation. Herudover afhænger resultaterne bl.a. af

• Baggrunds-fluorescens - mineralholdige prøver kan være vanskelige af aflæse.
• Krydsreaktion med andre organismer - kan medføre tidskrævende og vanskelig identifikationen, såfremt den forudgående oprensning er utilstrækkelig.
• Farvningens intensitet – fluorescensen kan aftage hurtigt og medføre at (oo)cyster ikke bliver opdaget, såfremt prøverne ikke aflæses indenfor kort tid.
• Mikroskopets kvalitet
• Erfaring/grundighed hvormed prøven aflæses.

1.5.2 Polymerase chain reaction (PCR)

Igennem de senere år er der forsket intensivt i udvikling af molekylære teknikker til detektion og identifikation af Cryptosporidium/Giardia arter og subtyper. Ved PCR amplifikation kan DNA fra ganske få organismer opformeres til målbare koncentrationer vha. specifikke primere. Teknikken rummer desuden mulighed for differentiering mellem levende og døde (oo)cyster (Wagner-Wiening & Kimmig, 1995), hvilket dog endnu ikke er implementeret på diagnostiske laboratorier.

Fordele: høj sensitivitet - teoretisk: en enkelt (oo)cyst (Stinear et al., 1996; Abbaszadegan et al., 1997). Kan anvendes til artsidentifikation af morfologisk identiske organismer. Kan i vid udstrækning automatiseres, hvorved tidsforbruget minimeres.

Ulemper: teknikken er ikke kvantitativ og udtrykker således ikke graden af kontamination i den undersøgte prøve. Amplifikationsprocessen hæmmes af en lang række stoffer i miljø- og vandprøver med risiko for falsk negative resultater. Risiko for falsk positive resultater ses ved anvendelse af uspecifikke primere.

1.6 Bestemmelse af viabilitet

Fundet af cryptosporidier hhv. Giardia i vandprøver er et udtryk for fækal forurening og derfor uønsket. Med henblik på vurdering af den aktuelle risiko ved indtagelse af det pågældende vand er det ikke desto mindre relevant også at undersøge, hvorvidt påviste protozoer er levende og dermed i stand til at inficere mennesker. Hertil anvendes nedenstående teknikker, der kan bruges enkeltvist eller i kombination. Viabilitetsundersøgelser kan vanskeligt kombineres med kvantitative studier og kræver som regel, at der udtages separate prøver til formålet.

1.6.1 Excystation

Excystation foregår normalt i tarmen men kan bringes til at finde sted i laboratoriet ved f.eks. regulation af temperatur eller tilsætning af enzymer og galdesalte (Blewett, 1989; Robertson et al., 1993). Andelen af oocyster, som er i stand til at excystere, i forhold til det totale antal oocyster anvendes som et udtryk for viabilitet. Metoden er anvendelig til at måle effekten af f.eks. desinfektionsmidler og forskellige stressfaktorer, men ikke velegnet til vurdering af oocyst-viabiliteten i miljøprøver pga. det lille antal oocyster, der oftest påvises. Har været anvendt i kombination med PCR til påvisning af levende Cryptosporidium oocyster (Wiedenmann et al., 1997).

1.6.2 Vital farvning

Inklusion eller eksklusion af det røde farvestof propidium iodid (PI) korrelerer med (oo)cysterne evne til at excystere og inficere inokulerede dyr (Schupp & Erlandsen, 1987; Campbell et al., 1992). Inklusion af PI kan derfor anvendes som udtryk for celledød.

PI farvning anvendes som regel sammen med 4,6 diamidino-2-phenyl indole (DAPI), et DNA farverstof, der ved inklusion i levende celler farver cellekernerne blå. Ved hjælp af DAPI/PI farvning kan der differentieres mellem 4 klasser (Campbell et al., 1992):

Tabel 1-1

DAPI farvning kan kombineres med IFA, hvorved specificiteten af testen øges, dvs. at det med større sikkerhed kan afgøres, hvorvidt en partikel er en oocyst eller ej.

DAPI/PI farvning er den mest anvendte teknik til bestemmelse af viabilitet i forbindelse med vand- og miljøprøver.

1.6.3 Infektivitetsundersøgelser in vivo (inokulation af mus)

Evnen til at forårsage infektion kan måles direkte ved inokulation af mus. Der er ingen standardmodel, men der anvendes som regel neonatale mus. Metoden er vidt udbredt til at vurdere forskellige stressfaktorers effekt på (oo)cyst-overlevelse, men svær at standardisere, etisk diskutabel og dyr. Tillige er C. hominis (syn. C. parvum genotype I) ikke infektiv for mus (Morgan-Ryan et al., 2002), og kan således ikke vurderes vha. denne metode. Af disse årsager er metoden ikke meget anvendt i forbindelse med undersøgelse af drikkevandsprøver. Det skal dog bemærkes, at både excystation og vitalfarvning har tendens til at overestimere viabiliteten (Black et al., 1996; Bukhari et al., 2000), hvilket er relevant i forbindelse med vurdering af den reelle risiko for mennesker i tilknytning til drikkevandsforurening.

1.6.4 Infektivitetsundersøgelser in vitro (dyrkning i cellekultur)

Som alternativ til inokulation af mus har dyrkning i cellekultur fået tiltagende udbredelse indenfor de seneste år. Vandprøverne koncentreres som ovenfor beskrevet, behandles evt. med klor med henblik på at undgå bakteriel vækst, og inokuleres i cellekultur (f.eks Upton et al., 1994; Slifko, 1997). Efter 24-48 timer undersøges kulturen for intracellulære parasit-stadier vha. immunofluorescens eller PCR (Rochelle et al., 1997). Sidstnævnte teknik muliggør specifik detektion af viable Cryptosporidium oocyster samt estimering af antallet af oocyster i prøven.

Sammenligning af EPA's metode 1623 og detektion af cryptosporidier vha. cellekultur og PCR viste ingen signifikant forskel mellem metoderne mht. genfindelsesprocent (LeChevallier et al., 2003), men teknikken er endnu ikke almindeligt anvendt.

1.7 Referencer

Abbaszadegan, M., Hubner, M.S., Gerba, C.P., Pepper, I.L. (1997). Detection of viable Giardia cysts by amplification of heat shock-induced mRNA. Applied and Environmental Microbiology 63, 324-328.

Albrechtsen HJ. 2003. Undersøgelse for patogener i udvalgte vandværker. Miljøprojekt nr. 786. Miljøstyrelsen.

Black, E.K., Finch, G.R., Taghi-Kilani, R., Belosevic, M. (1996). Comparison of assays for Cryptosporidium parvum oocysts viability after chemical disinfection. FEMS Microbiology Letters 135, 187-189.

Blewett, D.A. (1989). Disinfection and oocysts. In: Proceedings of the First International Workshop on Cryptosporidiosis (Eds. Angus, K.W., Blewett, D.A.), Edinburgh, September 7-8, 1988, pp.107-115.

Bukhari, Z., Marshall, M.M., Korich, D.G., Fricker, C.R., Smith, H.V., Rosen, J., Clancy, J.L. (2000). Comparison of Cryptosporidium parvum viability and infectivity assays following ozone treatment of oocysts. Applied and Environmental Microbiology 66, 2972-2980.

Bukhari, Z., Smith, H.V. (1996). Effect of three concentration techniques on viability of Cryptosporidium parvum oocysts removed from bovine faeces. Journal of Clinical microbiology, 33, 2592-2595.

Campbell, A.T., Gron, B., Johnsen, S.E. (1997). Immunomagnetic separation of Cryptosporidium oocysts from high turbidity water sample concentrates. Proceedings of the International Symposium on Waterborne Cryptosporidium (Eds. Fricker, C.R., Clancy, J.L., Rochelle, P.A.), March 1997, Newport Beach, CA, USA. Denver, CO, American Water Works Association, 91-96.

Campbell, A.T., Robertson, L., Smith, H.V. (1992). Viability of Cryptosporidium parvum oocysts – correlation of in vitro excystation with inclusion or exclusion of fluorogenic vital dyes. Applied and Environmental Microbiology 58, 3488-3493.

Campbell A.T., Robertson, L.J., Smith, H.V., Girdwood, R.V. (1994). Viability of Cryptosporidium parvum oocysts concentrated by calcium carbonate flocculation. Journal of Applied Bacteriology, 76, 638-639.

Clancy, J.L., Gollnitz, W.D., Tabib, Z. (1994). Commercial labs: how accurate are they? Journal of the American Water Works Association, 86, 89-97.

Connell, K., Scheller, K., Miller, K., Rodgers, C.C. (2000). Performance of methods 1622 and 1623 in the ICR supplemental surveys. Proceedings, American Water Works Association Water Quality Technology Conference, November 5-9, 2000, Salt Lake City, UT.

Graczyk, T.K., Cranfield, M.R., Fayer, R. (1996). Evaluation of commercial enzyme immunoassay (EIA) and immunofluorescent antibody (IFA) test kits for detection of Cryptosporidium oocysts of other species other than Cryptosporidium parvum. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 54, 274-279.

LeChevallier, M.W., Di Giovanni, G.D., Clancy, J.L., Bukhari, Z., Bukhari, S., Jeffrey, S.R., Sobrinho, J., Frey, M.M. (2003). Comparison of method 1623 and cell culture-PCR for detection of Cryptosporidium spp. in source waters. Applied and Environmental Microbiology 69, 971-979.

McDonald, V., Deer, R.M.A., Nina, J.M.S., Wright, S., Chiodini, P.L., McAdam, K.P.W.J (1991). Characteristics and specificity by hybridoma antibodies against oocyst antigens of Cryptosporidium parvum from man. Parasite Immunology 13, 251-259.

Morgan-Ryan UM, Fall A, Ward LA, Hijjawi N, Sulaiman I, Fayer R, Thompson RCA, Olson M, Lal A, Xiao L. 2002. Cryptosporidium hominis n. sp. (Apicomplexa: Cryptosporidiidae) from Homo sapiens. J. Eukaryot. Microbiol. 49: 433-440.

Musial, C.E., Arrowood, M.J., Sterling, C.R., Gerba C.P. (1987). Detection of Cryptosporidium in water by using polypropylene cartridge filters. Applied and Environmental Microbiology, 53, 687-692.

Mølgaard K, Nickelsen C, la Cour Jansen J. 2002. Hygiejnisk kvalitet af spildevand fra offentlige renseanlæg. Miljøprojekt nr. 684. Miljøstyrelsen.

Nieminski, E.C., Schaeffer, F.W., Ongerth, J.E. (1995). Comparison of two methods for detection of Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts in water. Applied and Environmental Microbiology, 61, 1714-1719.

Ongerth, J.E, Stibbs, H.H. (1987). Identification of Cryptosporidium oocysts in river water. Applied and Environmental Microbiology, 53, 672-676.

Robertson, L., Campbell, A.T., Smith, H.V. (1993). In vitro excystation of Cryptosporidium parvum. Parasitology 106, 13-19

Rochelle, P.A., Ferguson, D.M., Handojo, T.J., De Leon, R., Stewart, M.H., Wolfe, R.L. (1997). An assay combining cell culture with reverse transcriptase PCR to detect and determine infectivity of waterborne Cryptosporidium parvum. Applied and Environmental Microbiology 63, 2029-2037.

Rogers, M.R., Flanigan, D.J., Jakbowski, W. (1995). Identification of algae which interfere with the detection of Giardia cysts and Cryptosporidium oocysts and a method for alleviating this interference. Applied and Environmental Microbiology 61, 3759-3763.

Schupp, D.G., Erlandsen, L.S. (1987). A new method to determine Giardia cysts viability: correlation of fluorescein diacetate and propidium iodide staining with animal infectivity. Applied and Environmental Microbiology 53, 704-707.

Shepherd, K.M, Wyn-Jones, A.P. (1996). An evaluation of methods for the simultaneous detection of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts in water. Applied and Environmental Microbiology, 62, 1317-1322.

Slifko, T.R. (1997). An in vitro method for detecting infectious Cryptosporidium oocysts with cell culture. Applied and Environmental Microbiology 63, 3669-3675.

Stinear, T., Matusan, A., Hines, K. sandery, M. (1996). Detection of a single viable Cryptosporidium parvum oocyst in environmental concentrates by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology 62, 3385-3390.

Upton, S.J., Tilley, M., Brillhart, D.B. (1994). Comparative development of Cryptosporidium parvum (Apicomplexa) in 11 continuous host cell lines. FEMS Microbiology Letters 188, 233-236.

Vesey, G., Slade, J.S., Byrne, M., Shephard, K., Dennis, P.J., Fricker, C.R. (1993a). Routine monitoring of Cryptosporidium oocysts in water using flow cytometry. Journal of Applied Bacteriology 75, 87-90.

Vesey, G., Slade, J.S, Byrne, M., Shephard, K., Fricker, C.R. (1993b). A new method for the concentration of Cryptosporidium oocysts from water. Journal of Applied Bacteriology, 75, 82-86.

Wagner-Wiening , C., Kimmig, P. (1995). Detection of viable Cryptosporidium parvum oocysts by PCR. Applied and Environmental Microbiology 61, 4514-4516.

Wiedenmann, A., et al., (1997). A simple procedure for an exact evaluation of the sensitivity of the selective detection of viable Cryptosporidium oocysts by invitro excystation and PCR. In: Proceedings of the International Symposium on Waterborne Cryptosporidium (Eds. Fricker, C.R., Clancy, J.L., Rochelle, P.A.), March 1997, Newport Beach, CA, USA. Denver, CO, American Water Works Association, 109-114.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Februar 2006, © Miljøstyrelsen.