| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Evaluering af substratkontrol på de akkrediterede miljølaboratorier

3 Diskussion

• 3.1 Fortyndingsvæsker
• 3.2 Flydende substrater - Non-selektive bouilloner
• 3.3 Flydende substrater - Selektive/indikative bouilloner
• 3.4 Faste substrater - Non-selektive faste substrater
• 3.5 Faste substrater - Selektive og/eller indikative faste substrater
• 3.6 Kontrolstammer
• 3.7 Hyppighed af substratkontrol

Det er vigtigt at mikrobiologiske dyrkningsmedier, herunder fortyndingsvæsker, er underkastet en kvalitetskontrol før de tages i anvendelse, idet nøjagtigheden af analyseresultater i høj grad afhænger af de anvendte medier.

Der er mange måder at kontrollere substrater på. Det kan f.eks. være fysisk kontrol (dvs. farve, gelstyrke, homogenitet, overflade og lignende), pH-kontrol, sterilkontrol, volumenkontrol samt kontrol af om de ønskede mikroorganismer kan vokse i tilstrækkelig antal på det pågældende medium og for de selektive medier også om vækst af de ikke-ønskede mikroorganismer hæmmes i tilstrækkeligt omfang. Såfremt substratet er indikativ, bør det også undersøges om de korrekte typiske reaktioner opnås med målorganismerne.

Det fremgår af resultatet fra spørgeskemaerne, at alle de deltagende laboratorier, på nær et enkelt laboratorium, udfører kontrol af substrater. Funktionskontrolmetoderne varierer fra kvalitative til kvantitative eller semi-kvantitative metoder afhængig af laboratorium og/eller substrattype.

Sterilitet kan eftervises ved dokumentation af autoklaveringen; tid, temperatur og fyldningsgrad af autoklave. Dette forudsætter, at den anvendte kombination af parametrene tid, temperatur og fyldningsgrad en gang for alle er dokumenteret at resultere i sterile substrater. Sterilkontrol i form af mikrobiologiske analyser er egnede som verifikation af autoklavering, men er ikke brugbar som produktionsstyring.

Udover de nævnte funktionskontroller af de fremstillede substrater bør der foretages kontrol af pH og sterilitet af hvert batch. Sterilitetskontrollen kan som ovenfor nævnt bestå af kontrol af tid og temperatur for hvert batch. Faktuelle tid-temperatur forhold for varmebehandlingen af hver batch bør være dokumenterede.

I mange tilfælde medtages negativ kontrol ved hver analyse. Resultatet af spørgeskemaerne viser at nogle laboratorier opfatter negativ kontrol (ved hver analyse) som et ikke inokuleret substrat (en blindplade/-rør), andre laboratorier opfatter negativ kontrol som substrat podet med en negativ kontrolstamme og andre opfatter negativ kontrol som en analyse gennemført med fortyndingsvæske i stedet for prøven. Sidstnævnte anbefales, idet man herved får dokumentation for korrekt aseptisk analyseforløb. På tilsvarende vis vil man ved medtagelse af en positiv kontrolstamme i lavt niveau kunne opnå dokumentation for korrekt analyseforløb for så vidt angår overholdelse af tid og temperatur.

Såfremt der er vækst på den negative kontrol ved analysen, må resultatet forkastes. Årsagen til vækst kan enten være forurening under analyseforløbet eller et ikke sterilt udgangspunkt. Sidstnævnte vil ikke kunne afvises såfremt der ikke er dokumentation for sterilitet af partiet i forbindelse med fremstilling. Miljøanalyser skal gennemføres indenfor 24 timer efter prøveudtagning, hvorfor det ikke er muligt at lave analysen om på aflæsningstidspunktet, og det gælder derfor om at udelukke flest mulige fejlkilder før analysen i værksættes.

Hvis man ved hver analyse kun medtager positiv kontrolstamme og udelader sterilkontrollen (den upodede prøve) risikerer man ” falsk positive resultater” , fordi kontrollen af og dokumentationen for aseptiske arbejdsgange under analyseforløbet mangler. I ganske mange tilfælde kan man ikke på den positive kontrolplade skelne mellem tilsatte bakterier og bakterier hidrørende fra evt. forureninger. Hvis der er vækst på ” steril kontrollen” , bør analyseresultatet forkastes.

3.1 Fortyndingsvæsker

Opgørelsen i afsnit 2.1 viser, at langt den overvejende del af laboratorierne kontrollerer volumen af fortyndingsvæskerne. Korrekt sammensætning dokumenteres af nogle af laboratorierne ved kontrol af fortyndingsvæskens pH. Sterilkontrol forud for anvendelse af mediet udføres systematisk af laboratorium nr. 8 og 9.

Fortyndingsvæskerne indeholder salte, så mikroorganismer ikke udsættes for osmotisk chok ved overførsel fra prøven til fortyndingsvæsken. Desuden er fortyndingsvæsker fattige på næringsstoffer, da mikroorganismerne ikke skal vokse i fortyndingsmedierne, men blot kunne overleve. For at undgå vækst af mikroorganismerne i fortyndingsvæskerne, er det nødvendigt at begrænse opholdstiden i fortyndingsvæsken. Tidsintervallet fra prøven overføres til fortyndingsvæsken og indtil substrat påhældes bliver dermed en kritisk faktor. DS 2250:1983 ” Vandundersøgelse. Prøvetagning, transport og opbevaring af prøver til mikrobiologisk undersøgelse” giver ingen vejledning herom, men i EN ISO 6222 beskrives at der max må være 15 minutter mellem tilsætning af prøven (eller fortynding heraf) og agaren. NMKL nr. 91:2002 pkt. 7.5 beskriver, at der max må hengå 45 minutter fra fremstilling af 10-1 fortyndingen til sammenblanding med substrat.

For at sikre nøjagtige resultater af analyserne, er det vigtigt, at der anvendes korrekt volumen af fortyndingsvæsker og at fortyndingsvæskerne er sterile.

3.2 Flydende substrater - Non-selektive bouilloner

Formålet med anvendelse af mediet bør danne udgangspunkt for typen af kvalitetskontrol, der er forskel på den nødvendige præcision ved bestemmelse af kimtal som antal kolonidannende enheder og undersøgelse for patogene mikroorganismer såsom salmonella. I sidstnævnte tilfælde er man interesseret i at kunne detektere meget lavgradige forureninger, uanset bakteriecellerne kan være, og ofte er, stressede eller beskadigede. Ofte leder man efter ” bakterien” .

Udover at dokumentere sammensætning (fx målt ved pH) og sterilitet bør funktionaliteten af mediet dokumenteres før ibrugtagning af batch. Da man ikke kan tælle kolonidannende enheder på samme måde i bouilloner som på faste substrater, må man i hvert enkelt tilfælde overveje hvorvidt kvalitativ eller semikvantitativ kontrol af funktionaliteten er nødvendig. For så vidt angår phosphatbuffer med pepton anbefales semi-kvantitativ kontrol, idet evnen til opfriskning af stressede og eller beskadigede celler er væsentlig.

Spørgeskema undersøgelserne viser at 3 ud af 4 laboratorier foretager funktionskontrol af flydende non-selektive substrater før ibrugtagning af disse.

Eksempler på semi-kvantitativ kontrol er podning af flydende medier med mikroorganismer og efter inkubering at aflæse den uklarhed som vækst af mikroorganismerne har givet anledning til. Wickerhams kort kan anvendes som måleskala, kombineret med mikroskopi til bekræftelse af vækst af renkultur af den tilsatte organisme. En anden semi-kvantitativ kontrolmetode er fortyndingsmetoden, hvorved der fremstilles en fortyndingsrække af den opformerede kontrolstamme. Fra hver fortynding inokuleres 5 rør af det medium, der skal kontrolleres. Efter inkubation aflæses rørene for vækst og MPN værdien bestemmes. Produktivitetsforholdet bestemmes som forholdet mellem MPN værdien for det medium der skal kontrolleres og MPN værdien for reference mediet.

3.3 Flydende substrater - Selektive/indikative bouilloner

Ud over ovennævnte dokumentation af funktionaliteten; selve væksten af de ønskede mikroorganismerne og hæmning af de ” ikke-ønskede” mikroorganismer bør de indikative parametre også dokumenteres. Det anbefales at udføre batch kontrollen (dvs. forud for anvendelse af substratet) med såvel en positiv kontrolstamme som en negativ kontrolstamme. Under selve analysen er det tilstrækkelig at medtage en positiv kontrolstamme og en sterilkontrol i form af en ikke-podet prøve til dokumentation af korrekt analyseforløb. Selektive og/eller indikative bouilloner kan kontrolleres med ovennævnte semi-kvantitative metode, i kombination med registrering af at de indikative parametre virker.

Det fremgår af resultaterne af spørgeskema undersøgelserne at over 80% af laboratorierne foretager kontrol af de flydende substraters funktion før ibrugtagning.

3.4 Faste substrater - Non-selektive faste substrater

Kontrol af non-selektive substrater foretages ved kvantitativ eller semi-kvantitativ kontrol af funktionaliteten, såkaldt Growth Promotion Test (GPT), enten med modificeret Miles Misra metode eller ved økometrisk metode (semi-kvantitativ). Ved Miles Misra metoden undersøges væksten af den for mediet relevante mikroorganisme overfor væksten af samme mikroorganisme på non-selektiv referencesubstrat eller overfor foregående batch af samme medium. Produktivitetsforholdet (Productivity Ratio, PR-værdi) beregnes som forholdet mellem kolonitallet på det undersøgte medium og kolonitallet på referencemediet. For ikke- selektive medier anbefales i flg. NMKL proceduren en PR værdi på minimum 0,7.

Ved den økometriske metode bestemmes det absolutte vækstindeks (Absolute Growth Index, AGI). En overnatskultur af kontrolorganismen udstryges i et bestemt mønster på overfladen af det medium der skal testes. Efter inkubation aflæses hvilke streger (i udstrygningsmønsteret), der giver anledning til vækst, dette omsættes til en talværdi på en skala fra 0 til 5. Ikke selektive medier bør have AGI over 3.

Ved kontrol af non-selektive faste substrater er det tilstrækkeligt at medtage positive kontrolstammer.

Spørgeskema undersøgelserne viser at over 70% af laboratorierne foretager kontrol af substraterne forud for anvendelse enten ved modificeret Miles Misra metoden, ved økometrisk kontrol eller ved vækst kontrol.

3.5 Faste substrater - Selektive og/eller indikative faste substrater

For denne gruppe anbefales det at foretage kvantitativ funktionskontrol af substratet forud for anvendelse. Heri bør indgå såvel en positiv kontrolstamme i lavt niveau som en negativ kontrolstamme i højt niveau, således at både vækst af ” målorganismen” og den logaritmiske hæmning af følgefloraen kan dokumenteres. Ligeledes bør der være dokumentation for korrekte indikative reaktioner.

For selektive medier anbefales en log-5 forskel på produktivitetsforholdet (PR værdien) for negative og positive kontrolstammer. NMKL procedure nr. 10 anbefaler PR værdier på minimum 0,5 for positive kontrolstammer på selektive medier og PR på max 0,00001 for negative kontrolstammer, ved substratkontrol efter Miles Misra metoden. Anvendes den økometriske metode til selektive medier anbefales absolut vækstindeks for positive kontrolstammer over 2,5 og AGI under 2,0 for negative kontrolstammer.

Under selve analysen vil det være tilstrækkelig at medtage en positiv kontrolstamme og en sterilkontrol (en ikke podet prøve) til dokumentation af korrekt analyseforløb.

3.6 Kontrolstammer

Valget af hvilken type kontrolstamme, der skal anvendes, afhænger af dyrkningsmediet. For selektive og/eller indikative medier anvendes de for mediet relevante positive kontrolstammer (jvf. nedenstående tabel). I nogle tilfælde kan det være relevant at supplere med biokemisk atypiske kontrolstammer. Sidstnævnte kunne fx være tilfældet hvis der i et medium er indbygget flere selektive/indikative principper. For non-selektive medier vælges mikroorganismer, som kan vokse på mediet, og som findes i den matrix man anvender analysen til. Således er det relevant, jvf. tabel 10, at anvende E. coli og Pseudomonas fluorescens som positiv kontrol til Trypton gærekstrakt agar og mindre relevant at anvende en S. aureus stamme, idet førstnævnte er naturligt forekommende i vand, det er S. aureus ikke.

Nedenstående tabel er et eksempel på hvilke mikroorganismer det kunne være relevante at anvende til kontrol af de forskellige dyrkningsmedier, men der vil let kunne argumenteres for brug af andre og flere lige så relevante mikroorganismer, jvf. ovenstående om selektive og indikative dyrkningsmedier.

Tabel 23 Eksempler på relevante kontrolstammer.

Ved anvendelse af positive og negative kontrolstammer er det vigtigt, jvf. DS EN 17025 og EAL Guidelines for Microbiology, at disse er sporbare til en anerkendt kultursamling. Anvendelse af bakteriestammer skal foregå styret, idet en n'te generations bakterie ikke kan have samme egenskaber som naturligt forekommende bakterier. Bakterier kan hurtigt tilpasse sig laboratorieforhold med det resultat, at man risikerer, at man ved hjælp af standardmetoder ikke kan påvise naturligt forekommende bakterier. Man bør ikke benytte sig af ældre kulturer end 5. generation fra moderstammen.

Det podeniveau der anvendes ved substratkontrollen er en væsentlig faktor. Ved analyserne skal laboratorierne kunne detektere mikroorganismer i lavt antal, og substratkontrollen skal kunne vise, at medier er i stand til at restituere mikroorganismer i lavt antal. Desuden er det vigtig at undgå problemer med sammenflydning af kolonier og overvoksede plader, således at korrekt kolonimorfologi og tilstedeværelse af renkultur ikke kan kontrolleres. I de fleste tilfælde vil det være fornuftigt at anvende et podeniveau på 10 til 100 cfu af positive kontrolstammer. Når det drejer sig om de negative kontrolstammer er situationen den modsatte, idet selektive medier skal kunne modstå et vist pres fra følgefloraen og ofte vil det være fornuftigt at anvende 10.000 til 100.000 cfu som podeniveau.

3.7 Hyppighed af substratkontrol

Spørgeskema undersøgelsen viser at hyppigheden af substratkontrol i form af GPT-test er per leverandørbatch eller per fremstillet batch. Nødvendigheden af at udføre GPT-test på hvert fremstillet batch kan diskuteres. Producenter af tørsubstrater udfører typisk GPT-test forud for frigivelse af partier til salg, og ofte medfølger denne kvalitetsdokumentation, når laboratorier indkøber dyrkningsmedier. Såfremt laboratoriet benytter sig af færdigblandede tørsubstrater, vil det ofte være tilstrækkeligt at udføre én GPT-test per leverandørbatch. Dette forudsætter (jvf. ISO 7218) at tørsubstrat opbevares ved anvist temperatur, at det anvendes indenfor holdbarhedstiden, at tørsubstratet ikke klumper og ikke smuldrer, at der ikke er misfarvninger, at korrekt mængde tørsubstrat afvejes til korrekt mængde vand og at varmebehandlingen gennemføres korrekt. I NMKL procedure nr. 10 beskrives det, at såfremt laboratoriet benytter ISO 9000 godkendte leverandører af tørsubstrater vil det være tilstrækkeligt at udføre GPT test når der tages en ny type substrat i arbejde i laboratoriet eller hvis laboratoriet skifter leverandør.

Dyrkningsmedier som laboratoriet selv fremstiller ved afvejning af enkelt ingredienser er behæftet med større usikkerhed, og det vil derfor være hensigtsmæssigt at udføre GPT test med større hyppighed fx på hvert fremstillet batch.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Februar 2006, © Miljøstyrelsen.