|
Vurdering af metodeskifte for coliforme bakterier i drikkevand 2 Coliforme bakterier
Ved coliforme bakterier forstås Gram-negative, ikke-sporedannende, oxidase-negative, stavformede bakterier, som er i stand til at vokse aerobt og fakultativt anaerobt ved tilstedeværelse af galdesalte, og som normalt er i stand til at fermentere laktose under produktion af syre og aldehyd efter inkubering ved 36 +/-2 grader i 24 timer. Som en del af laktosefermenteringen producerer coliforme bakterier enzymet ß-galactosidase. 2.1 Definition af Coliforme bakterier ud fra litteraturenI det følgende præsenteres en række centrale referencers definition på coliforme bakterier. 2.1.1 WHO’s Guidelines for Drinking waterI WHO’s Guidelines for Drinking-Water Quality 2006 (3) er det angivet, at traditionelt blev coliforme bakterier betragtet som hørende til slægterne Escherichia, Citrobacter, Klebsiella og Enterobacter. Men gruppen er mere heterogen og omfatter flere slægter som f.eks. Serratia og Hafnia. Gruppen coliforme bakterier omfatter således arter, som både kan findes i fæces og i miljøet. Coliforme bakterier omfatter organismer, som kan overleve og vokse i vand, og coliforme bakterier er derfor ikke anvendelig som mål for fækal forurening, men de er procesindikator, der viser effektiviteten af en proces som f.eks. desinfektion af drikkevandet. De kan også anvendes til at vurdere/bedømme den hygiejniske kvalitet af drikkevandet og den potentielle tilstedeværelse af biofilm. Coliforme bakterier forekommer både i spildevand og vandmiljøet. Nogle af disse bakterier udskilles med fæces fra mennesker og dyr, men mange coliforme bakterier er heterotrofe og er i stand til at formere sig i vand og jord. Coliforme bakterier kan også overleve og vokse i ledningssystemet, især i tilstedeværende biofilm. 2.1.2 UK’s Mikrobiology of Drinking WaterI The Microbiology of Drinking Water (2002) - part 1- Water Quality and Public Health (4) er det nævnt, at tilstedeværelse af coliforme bakterier ikke altid indikerer en sundhedsmæssig risiko, men at deres påvisning er en indikation på, at vandbehandlingsprocesserne bør gennemgås. Det nævnes endvidere, at nogle coliforme bakterier kan stamme fra ikke-fækale kilder i miljøet, som f.eks. jord eller rådnende plantedele, eller kan vokse i vandige miljøer. Eksempler på disse bakterier er Serratia fonticola og Klebsiella terrigena, som er bakterier, der normalt findes i vand. Disse bakterier er ikke af nogen sundhedsmæssig betydning. Citrobacter, Klebsiella og Enterobacter, der hører til de coliforme bakterier, kan findes i fæces samt i jord og vand. Adskillige medlemmer af coliform gruppen vides at kunne være til stede i jord og andre miljømaterialer og er i stand til at vokse i næringsrigt vand og biofilm. Som resultat heraf betragtes coliforme bakterier ikke længere som en indikator på fækal forurening. Men nogle arter af coliforme bakterier kan, selv om de er almindeligt forekommende i miljøet, associeres med humane infektioner, dog sjældent med gastro-enteritis. 2.1.3 US Environmental Protection AgencyUS Environmental Protection Agency (EPA) (5)) beskriver, at coliforme bakterier er almindeligt forekommende i miljøet, og at de almindeligvis ikke udgør en sundhedsmæssig risiko. Tilstedeværelse af coliforme bakterier i drikkevand er som regel tegn på problemer i vandbehandlingsanlægget eller i ledningsnettet, som indikerer, at systemet kan være blevet forurenet med sygdomsfremkaldende bakterier. EPA sætter som mål, at drikkevand ikke indeholder coliforme bakterier. Den lovmæssige grænseværdi er, at der maksimalt må kunne påvises coliforme bakterier i 5% af prøverne (5). For vandforsyninger, som udtager mindre end 40 prøver per måned må der dog højst forekomme én positiv prøve per måned. Hvis der påvises coliforme bakterier, skal der udtages en ny bakteriologisk prøve indenfor 24 timer. Hvis denne prøve også er positiv for coliforme bakterier, skal vandprøven yderligere undersøges for fækale coliforme bakterier og for E. coli. 2.1.4 Miljøstyrelsens vejledning om mikrobiologiske overskridelserI Miljøstyrelsens vejledning nr. 4, 2005 om håndtering af overskridelser af de mikrobiologiske drikkevandsparametre (6) defineres coliforme bakterier som ”medlemmer af familien Enterobacteriaceae, der er i stand til at danne syre og luft fra laktose ved temperaturer på 35-37°C indenfor 48 timer. Denne definition omfatter bl.a. medlemmer af slægterne Enterobacter, Erwinia, Eschericia, Klebsiella og Serratia samt visse medlemmer af slægten Citrobacter”. De nævnte slægter inden for de coliforme bakterier er – med undtagelse af E. coli – naturligt forekommende i jord, rådnende plantedele og i overfladevand. Påvisning af coliforme bakterier i drikkevand kan tyde på forurening fra overfladevand, plantedele og/eller jord, men ikke altid på forurening med fækalier. 2.1.5 DelkonklusionColiforme bakterier er laktose positive enterobacteriaceae. Bakteriegruppen er almindelig forekommende i jord, vand og på planter. Tilstedeværelse af coliforme bakterier i desinficeret vand er tegn på forurening – evt. med sygdomsfremkaldende mikroorganismer. Tilstedeværelse af coliforme bakterier i ubehandlet drikkevand kan tyde på forurening med overfladevand, plantedele og/eller jord, men ikke altid på forurening med fækalier. 2.2 Coliforme bakterier i henhold til de anvendte analysemetoderTil bestemmelse af mikroorganismer inden for mikrobiologiske undersøgelsesmetoder benyttes en substratafhængig definition. 2.2.1 MPN-metoden (DS 2255)I den tidligere anvendte danske metode (DS 2255) er coliforme bakterier defineret som stavformede, ikke sporedannende, gramnegative, fakultativt anaerobe bakterier, der kan vokse ved tilstedeværelse af galdesalte, og som er i stand til at danne syre og luft ved forgæring af laktose ved 37 ± 1° C indenfor 48 timer. DS 2255 er en MPN (Most Probable Number) metode (7), der er baseret på udsæd af delmængder, normalt 1x50 ml, 5x10 ml og 5x1 ml vand i det flydende dyrkningsmedium MacConkey bouillon. MacConkey bouillon indeholder galdesalt, som hæmmer Gram positive bakterier, men ikke Enterobacteriaceae. Mediets indhold af laktose vil ved forgæring medføre syredannelse (gulfarvning af mediet) og luftdannelse. På grundlag af kombinationen af kulturer med positiv og negativ reaktion findes det mest sandsynlige antal coliforme bakterier ved statistisk udregning (opslag i MPN tabel). Metodens svaghed er, at de selektive galdesalte, der er tilsat for at hæmme følgefloraen, kan hindre vækst af stressede/svækkede bakterier, hvorfor man vil finde færre coliforme bakterier end hvis man benytter andre metoder som f.eks. membranfiltreringsmetoder. 2.2.2 Referencemetoden ISO 9308-1 (EU-referencemetode)Referencemetoden, ISO 9308-1 (8), definerer coliforme bakterier som oxidase-negative og laktose-positive bakterier. Laktose-positive bakterier er i stand til at danne kolonier ved aerob dyrkning ved 36 ± 2°C på et selektivt laktoseholdigt medium og danne syre indenfor 21 ± 3 timer. Metoden indebærer membranfiltrering med efterfølgende dyrkning på selektiv agar (TTC-Tergitol agar) og biokemisk verifikation af suspekte kolonier. Når coliforme bakterier omsætter laktose, farves mediet gult (fordi bakterierne samtidig danner syre), herved visualiseres de positive kolonier, således tælling kan foretages. Verifikation indebærer rendyrkning med efterfølgende oxidasetest af de suspekte kolonier. Metoden har den svaghed, at mediet har lav selektivitet, hvorfor man i vandprøver med højt kimtal vil kunne se, at andre bakterier (ikke-coliforme enterobacteriaceae og andre Gram negative bakterier) kan overvokse filteret, så man ikke kan se, ikke tælle og ikke verificere de enkelte suspekte kolonier. 2.2.3 Colilert Quanti Tray (Colilert metoden)Colilert metoden (9), definerer coliforme bakterier som ONPG-positive bakterier (ONPG: o-nitrophenyl-b-D-galactopyranosid). Metoden er baseret på enzymatiske reaktioner. Coliforme bakterier producerer enzymet beta-galactosidase og kan dermed omsætte substratets o-nitrophenyl til den gule forbindelse o-nitrophenol, såkaldt ONPG-positive bakterier. Coliforme bakterier påvises ved gulfarvning af mediet. Metoden indebærer, at 100 mL vandprøve tilsættes et defineret substrat. Efter opblanding ophældes suspensionen i en Quanti Tray bakke med 51 brønde, og bakken lukkes. Bakken inkuberes ved 37 ± 1°C i 18 (eller 24) timer. Efter inkubation aflæses antallet af gule brønde (gul i forhold til en referenceplade). Ved hjælp af en MPN tabel (statistisk beregning) omregnes antallet af gule brønde til det mest sandsynlige antal coliforme bakterier i prøven. 2.2.4 Vurdering af de tre metoder2.2.4.1 Sammenligning af MPN-metoden og Colilert64 vandprøver blev analyseret med MPN-metoden (DS 2255) og Colilert (2). I 13 af de 64 analyserede vandprøver blev der påvist coliforme bakterier. Resultaterne af de positive prøver er angivet i tabel 1 Tabel 1 Resultaterne af coliforme analyser fra 13 prøver af vand med MPN-metoden og Colilert
Det fremgår heraf, at Colilert-metoden påviste coliforme bakterier i 12 prøver og DS 2255 kun i 8 prøver. Anvendelse af Colilert medførte en stigning i antallet af prøver, der indeholdt coliforme bakterier. 2.2.4.2 Sammenligning af MPN-metoden, EU-referencemetoden og ColilertUndersøgelser (2) af naturlige prøver med henholdsvis MPN-metoden, EU-referencemetoden og Colilert viste, at den tidligere anvendte danske MPN-metode (DS 2255) ikke var i stand til at påvise coliforme bakterier i nogen af prøverne. Tabel 2: Resultater af analyse af naturlige prøver fra 7 vandværker for coliforme bakterier . I ingen af prøverne blev der påvist E. coli .
Ud fra tabel 2 fremgår det, at coliforme bakterier er påvist i 4 prøver ud af 7 med Colilert metoden og i 1 prøve med EU-referencemetoden (ISO 9308-1). I ingen af prøverne blev påvist coliforme bakterier med MPN metoden (DS 2255). Colilert metoden er, som det fremgår af ovennævnte tabel 2 og som dokumenteret i ækvivalensstudiet (2), mere nøjagtig end referencemetoden (ISO 9308-1) og den tidligere anvendte danske metode (DS 2255). 2.2.4.3 AnalyseusikkerhedSom illustreret i nedenstående tabel 3 gælder for MPN-metoden (DS 2255), at ved påvisning af 1 coliform bakterie pr 100 mL indeholder prøven med 95% sandsynlighed mellem 0,5 og 7 coliforme bakterier per 100 mL. Tilsvarende gælder for Colilert metoden, at ved påvisning af 1 coliform bakterie pr 100 mL indeholder prøven med 95% sandsynlighed mellem 0,3 og 5.6 coliforme bakterier per 100 mL. For EU-referencemetoden gælder, at ved påvisning af 1 coliform bakterie pr. 100 mL, indeholder prøven med 95% sandsynlighed mellem 0-3 coliforme bakterier pr. 100 mL. Tabel 3: Analyseusikkerhed på analyseresultater
Usikkerheden på kolonital antages at være Poisson fordelt, og 95% konfidens interval er beregnet som a ± 1,96 va, hvor a er kolonitallet. Alle tre analysemetoder har en detektionsgrænse på 1 coliform bakterie per 100 mL, som stort set svarer til kvalitetskravet for coliforme bakterier i drikkevand (0 pr. 100 mL). Som det fremgår af tabel 3 er usikkerheden på mikrobiologiske analyser stor ved lave kimtal. I ækvivalensstudiet (2) er anført flere mulige forklaringer til bedre genfindelse af coliforme bakterier med Colilert metoden end med EU-referencemetoden. Det nævnes bl.a., at følgefloraen kan overvokse kolonier af coliforme bakterier, og at følgefloraen kan hæmme væksten af coliforme bakterier. Flere bakterier kunne påvises at have enzymaktivitet uden at de samme organismer nødvendigvis vil kunne omsætte laktose, bl.a. på grund af hæmmende stoffer i dyrkningsmediet. Referencemetoden indebærer membranfiltrering af prøven, og membranfiltrering i sig selv vil kunne stresse bakterierne, pga. trykpåvirkning og udtørring, således at omsætning af laktose ikke vil kunne ske. Yderligere er Colilert mediet mere selektivt end den agar, der benyttes i referencemetoden. I Miljøprojekt 934 (10) konkluderes det, at Colilert metoden er bedre egnet til detektion af svækkede og stressede bakterier, fordi den baserer sig på detektion af enzymaktivitet. Stressede bakterier kan, som beskrevet af Bjergbæk og Roslev (11), have enzymaktivitet og foretage celledeling uden at være i stand til at vokse frem ved traditionelle dyrkningsmetoder. Bakterierne er til stede i prøven, men vil ikke vokse i MacConkey bouillon (DS 2255) eller på TTC agar (ISO 9308-1). Men da svækkede/stressede bakterier kan have enzymaktivitet, vil disse kunne påvises med Colilert metoden. Der kan derfor forekomme tilfælde, hvor der påvises coliforme bakterier ved Colilert metoden, men ikke ved ISO metoden (og ikke ved DS 2255). Coliforme bakterier hører ikke til den naturlig forekommende flora i drikkevand. Drikkevand er et dårligt vækstmedium for coliforme bakterier, fordi det er næringsfattigt. Men hvis coliforme bakterier er kommet ind i drikkevandssystemet, kan de overleve i drikkevand i flere måneder (12). Coliforme bakterier kan være i en stresset eller svækket tilstand når de isoleres fra drikkevand. Bjergbæk og Roslev (11) benævner tilstanden som ”levende men ikke dyrkbar (VBNC)”, hvilket gør, at bakterierne ikke kan påvises med de traditionelle dyrkningsmetoder. Umiddelbart efter forureningen kan bakterierne detekteres med dyrkningsmetoder. Senere i forureningsforløbet bliver de som følge af stress og ”sult” ikke påviselige ved almindelige dyrkningsmetoder, men er påviselige med molekylærmetoder. I ledningsnettet vil mikroorganismerne have mulighed for at leve i fx biofilm, og her vil de være påviselige med almindelige dyrkningsmetoder. 2.2.5 DelkonklusionSom det fremgår af ovenstående metodegennemgang, er der tale om tre forskellige påvisningsprincipper, hvor det ikke i alle tilfælde er de samme bakterier, der påvises ved de tre nævnte metoder. Der vil kunne forekomme tilfælde, hvor prøver er positive med kun en af metoderne. Forskelle i ledsagefloraen i drikkevandet vil kunne påvirke analyseresultatet, fx vil der ved højt kimtal være risiko for, at det benyttede filter, ved analyse efter referencemetoden, vil være overvokset med andre bakterier så evt. coliforme bakterier ikke kan påvises. Analyseresultatet er også afhængigt af, hvor de coliforme bakterier befinder sig i deres vækstcyklus. Stressede bakterier er svære at påvise ved almindelige dyrkningsmetoder, mens bakterier i den logaritmiske vækstfase vil kunne påvises ved alle dyrkningsmetoderne. Referencemetoden (ISO 9308-1) og Colilert metoden er bedre end den hidtidige danske MPN metode (DS 2255), fordi de kan påvise flere end med den hidtidige danske metode. Colilert metoden er endvidere bedre end den tidligere anvendte danske metode (DS 2255) og referencemetoden, fordi Colilertmetoden også kan påvise svækkede og stressede bakterier. Usikkerheden på de mikrobiologiske analyser er stor i de lave niveauer, og kvalitetskravet er stort set sammenfaldende med påvisningsgrænsen. 2.3 Anvendelse af Coliforme bakterier ud fra litteraturenI det følgende præsenteres en række centrale referencers tolkning på coliforme bakterier. 2.3.1 WHO’s Guidelines for Drinking WaterI WHO’s Guidelines for Drinking-water Quality (3) angives det, at eksistensen af både ikke-fækale bakterier, som hører ind under definitionen coliforme bakterier, og af laktose-negative coliforme bakterier begrænser anvendeligheden af gruppen af coliforme bakterier som indikator på fækal forurening. I desinficeret vand må coliforme bakterier ikke være tilstede, og tilstedeværelse af disse indikerer en utilstrækkelig desinfektion. Tilstedeværelse af coliforme bakterier i ledningssystemet kan tyde på eftervækst og mulig dannelse af biofilm eller forurening ved indtrængning af fremmed materiale, som f.eks. jord eller plantedele. 2.3.2 UK’s Microbiology of Drinking WaterThe Microbiolgy of Drinking Water (2002) – Part 1 – Water Quality and Public Health (4) anbefaler, at når der påvises coliforme bakterier i desinficeret drikkevand, bør de bakterier, der påvises, artsbestemmes med henblik på at finde kilden til forureningen og betydningen af de påviste bakterier. Fund af coliforme bakterier og fravær af E. coli men samtidig tilstedeværelse af enterokokker kan indikere, at vandet er fækal forurenet. Årsagen til påvisning af coliforme bakterier i drikkevand kan være resultatet af sub-optimal drift af desinfektionssystemet eller indtrængning fra brud i ledningssystemet. 2.3.3 US Environmental Protection AgencyHvis der påvises coliforme bakterier i drikkevandet, er det et advarselstegn om, at drikkevandet er følsomt for forureninger, dvs. de styrende foranstaltninger er ikke tilstrækkelige til forebyggelse af sundhedsmæssige risici. Der er ikke nødvendigvis tale om fækal forurening. 2.3.4 Miljøstyrelsens vejledning om mikrobiologiske overskridelserI Miljøstyrelsens vejledning nr. 4, 2005 om håndtering af overskridelser af de mikrobiologiske drikkevandsparametre (6) er det angivet, at påvisning af coliforme bakterier i drikkevand kan tyde på forurening med overfladevand, plantedele og/eller jord, men ikke altid på forurening med fækalier (afføring). Coliforme bakterier kan vokse i ledningsnettet og kan optræde længe, op til 3 måneder, i ledningsnettet – ikke mindst i samspil med biofilm og evt. sediment i bunden af ledningerne (12). Reul et al (13) kunne ved analyse (ISO 9308-1) af større prøvevoluminer (1 L) påvise coliforme bakterier i prøver fra ledningsnet mange uger efter forureningen. 2.3.5 DelkonklusionColiforme bakterier er, såfremt der foretages desinfektion af drikkevand, egnet til vurdering af, om desinfektionen har været effektiv. Hvis der ikke foretages desinfektion af drikkevandet, hvilket ikke sker i Danmark, kan niveauet af coliforme bakterier bruges til at vurdere om et vandforsyningsanlæg fungerer optimalt og om det er tæt, så der ikke kan tilledes nogen form for forurening til råvandet, til vandbehandlingsprocesserne eller til forsyningsnettet. Lave fund af coliforme bakterier kan være tegn på, at der enten har været en forurening eller at forureningen er ved at klinge af. Coliforme bakterier er ikke egnet som indikator for fækal forurening, men som en procesindikator, der viser effektiviteten af en proces. Det kan konkluderes, at påvisning af coliforme bakterier, uden samtidig påvisning af E. coli, er tegn på forurening fra miljøet/omgivelserne. Der er ikke nødvendigvis tale om en fækal forurening. Fund af coliforme bakterier og fravær af E. coli men samtidig tilstedeværelse af enterokokker kan indikere fækal oprindelse af de coliforme bakterier. Når coliforme bakterier først er kommet ind i drikkevandssystemet, er de svære at fjerne. Coliforme bakterier kan overleve længe i ledningsnettet. Spørgsmålet er om et lavt antal coliforme bakterier til stadighed er til stede i drikkevandet, og om det er et spørgsmål om tilfældigheder, hvorvidt bakterierne påvises ved analysen.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||