Pesticides Research No. 111 2007 – Effects of azole fungicides on the function of sex and thyroid hormones

Effects of azole fungicides on the function of sex and thyroid hormones

Sammenfatning

Baggrund

Der er en stigende bekymring for, at selv lave eksponeringer for pesticider under udviklingen af reproduktionsorganer og nervesystem, kan medføre vedvarende skader på disse organsystemer. Fostre (og hermed gravide kvinder) og børn antages derfor at være særlige sårbare grupper i forhold til pesticideksponering.

Det overordnede formål med dette projekt var at undersøge effekter af tre hyppigt anvendte triazolfungicider, tebuconazol, propiconazol og epoxiconazol, på det endokrine system med speciel fokus på køns- og skjoldbruskkirtelhormoner. Desuden ønskede vi at sammenligne resultaterne med vores tidligere fund for imidazolfungicidet prochloraz, som viste sig at have hormonforstyrrende egenskaber i en række in vitro og in vivo undersøgelser. Hvis de tre triazolforbindelser har tilsvarende effekter som prochloraz tyder det på at disse effekter er generelle for azolfungicider.

Azol-fungicider anvendes i store mængder til bekæmpelse af svampesygdomme i kornafgrøder og i mindre omfang i prydplante-, grøntsags- og frugtproduktionen. I 2005 blev der således i Danmark samlet anvendt over 100 t aktivstof af disse midler. Da de er relativt fedtopløselige og let optages over mave-tarmkanalen kan befolkningen blive udsat for stofferne, hvis de findes som rester i fødevarerne. Aktuelt kontrolleres restindholdet af stofferne i frugt og grønt, men kun få azol-fungicider måles i korn og kornprodukter. Bl.a. måles det mest anvendte azol-fungicid, epoxiconazol, ikke, hvorfor det ikke er muligt at foretage en samlet vurdering af befolkningens eksponering gennem kosten. Generelt har azol-fungiciderne en lav akut giftighed, men der vides meget lidt om deres mulige sundhedsrisici ved lave kroniske eksponeringer. Vi har for nylig vist at azol-fungicidet, prochloraz, kan interagere med flere forskellige receptorer, heriblandt østrogenreceptoren (ER), androgenreceptoren (AR) og arylhydrocarbon receptoren (AhR) i cellebaserede in vitro assays. Desuden virkede prochloraz anti-androgent i voksne hanrotter og påvirkede serumkoncentrationerne af skjoldbruskkirtelhormoner. Ved eksponering i drægtighedsperioden og under diegivningen medførte stoffet en virilisering af hun-ungerne og en feminisering af han-ungerne.

AhR er en nuklear transkriptionsfaktor, som efter binding af ligand, medfører øget genekspression af AhR responsive gener så som CYP1-genfamilien. Den klassiske AhR ligand er 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) men også andre planare aromatiske polycycliske molekyler kan aktivere receptoren. Der er endnu ikke identificeret en naturlig endogen ligand. AhR medieret induktion af CYP1A1 og 1A2 vil blandt andet føre til øget omdannelse af østradiol til 2- og 4-hydroxyøstradiol og kan derfor påvirke organismens hormonkoncentration.

I dette projekt har vi undersøgt om de tre mest anvendte triazol-forbindelser i Danmark: epoxiconazol, propiconazol og tebuconazol, besidder de samme egenskaber som imidazolfungicidet prochloraz med hensyn til at reagere med ER, AR og AhR og til at påvirke steroidhormonsyntesen og aktiviteten af enzymet aromatase, som konverterer testosteron til østrogen. Effekterne er undersøgt i etablerede in vitro assays. Desuden har vi etableret et bioassay (T-screen) til at undersøge binding til og aktivering af receptoren for skjoldbruskkirtlens hormoner, thyroxin (T4) og tri-iodothyronin (T3), og anvendt dette assay til at undersøge om prochloraz, epoxiconazol, propiconazol og tebuconazol kan virke som T3/T4 agonister eller antagonister.

Dernæst har vi undersøgt anti-androgene virkninger for tebuconazol og propiconazol in vivo i unge voksne hanrotter i Hersberger testen. Endelig er effekter på fostres udvikling undersøgt for epoxiconazol og tebuconazol ved at dosere hunrotter i drægtigheds- og diegivningsperioden og undersøge fostre og unger.

Årsagen til at propiconazol blev erstattet med epoxiconazol i undersøgelserne vedrørende effekter på fostrets udvikling, er at vi efter projektets start fik oplysninger om at forbruget af epoxiconazol var steget markant i 2004 og nu var det mest anvendte azolfungicid i dansk landbrug.

In vitro effekter

De tre azolfungicider, propiconazol, tebuconazol og epoxiconazol kunne alle, i lighed med prochloraz, virke hormonforstyrrende via flere forskellige mekanismer, selvom deres potens i nogle assays var lavere end for prochloraz.

De tre triazoler var således mindre potente ER antagonister (prochloraz > tebuconazole » epoxiconazole » propiconazole) og AhR agonister (prochloraz >>> tebuconazole » epoxiconazole » propiconazole) end prochloraz mens deres affinitet for AR svarede til prochloraz. Ligesom prochloraz hæmmede triazolerne enzymet aromatase dog igen med mindre potens end prochloraz (prochloraz >epoxiconazole » tebuconazole > propiconazole).

Evnen til at påvirke syntesen af steroidhormoner blev undersøgt i en human binyrebark-cancercelle H295R. I lighed med prochloraz øgede alle tre triazolfungicider produktionen af progesteron mens produktionen af testosteron og østrogen var reduceret. Dette indikerer en hæmning af enzymer som er involveret i omdannelsen af progesteron til testosteron.

Ingen overbevisende effekter blev observeret med hensyn til interaktion med receptoren for skjoldbruskkirtlens hormoner for hverken prochloraz eller nogle af triazolerne.

Anti-androgene virkninger in vivo

I Hershberger testen, hvor anti-androgene effekter undersøges in vivo, havde hverken propiconazol eller tebuconazol i doserne 50, 100 eller 150 mg/kg lgv/dag nogen effekt på vægten af reproduktionsorganer eller på hormonniveauer, undtagen for den højeste dosis af propiconazol, hvor der var en signifikant stigning i serumkoncentrationen af follikel stimulerende hormon (FSH). Den eneste signifikante effekt på genekspressionen var nedsat ekspression af ornithin decarboxylase (ODC) mRNA i ventrale prostata ved alle doser af propiconazol og ved den højeste dosis af tebuconazol. Dette gen reguleres af androgener, men også via andre mekanismer. Da der ikke sås andre anti-androgene effekter (nedsat vægt af androgenafhængige organer, nedsat ekspression af andre androgenregulerede gener eller en stigning i LH) er det sandsynligt, at den observerede effekt på ODC mRNA skyldes en mekanisme som ikke er reguleret af androgener.

Konklusionen er derfor, at ingen af de to triazol-fungicider, propiconazol eller tebuconazol, blokerer androgen receptoren in vivo i Hershberger testen ved doser på 150 mg/kg lgv/dag og derunder. Dette er i kontrast til prochloraz, som inducerede markante anti-androgene effekter i Hersberger assayet ved doser mellem 50 og 150 mg/kg lgv/dag.

Effekter på afkommet efter perinatal eksponering

Drægtige rotter blev doseret med epoxiconazol (15 eller 50 mg/kg lgv/dag) eller tebuconazol (50 eller 100 mg/kg lgv/dag). Nogle dyr fik udført planlagt kejsersnit på gestationsdag (GD) 21 for at undersøge effekter på fostrene. Andre dyr fødte normalt og afkommet blev undersøgt enten ved fødslen eller postnatal dag (PND) 13 eller 16 efter at havde været yderligere eksponeret gennem modermælken. Den højeste dosis af epoxiconazol medførte øget fosterdød og gav tydelige problemer med de almindelige fødsler. Derfor blev der kun født 2 kuld mens de resterende moderdyr i denne gruppe fik foretaget kejsersnit mellem GD23 og GD25 og blev inkluderet i gruppen som fik foretaget kejsersnit ved GD21. Tolkningen af resultaterne fra undersøgelser af unger fra højdosis epoxiconazol gruppen er derfor vanskelige og der kan ikke drages endelige konklusioner.

De nedenstående effekter blev observeret for moderdyr, fostre og afkom:

Både epoxiconazol og tebuconazol øgede drægtighedslængden. Det har vi også tidligere set for prochloraz (30 mg/kg lgv/dag). Denne effekt skyldes sandsynligvis, at azol-fungiciderne inducerer et øget progesteron niveau hos mødrene.

Afstanden mellem anus og kønsorganerne (’anogenital distance’, AGD) var øget i hununger efter dosering af mødrene med den højeste dosis af tebuconazole, samt den laveste dosis af epoxiconazol. Dette indikerer en virilisering af hunungerne. For de samme to dosisgrupper var der ingen effekt på AGD i nyfødte hanunger. Efter dosering med den højeste dosis tebuconazol var testosteronkoncentrationen i hanfostrenes testikler nedsat, mens progesteron og 17a-hydroxyprogesteron var øget ved begge doser af tebuconazol. Tebuconazole medførte yderligere en signifikant stigning i antallet af brystvorter samt en tendens til nedsat plasmakoncentration af testosteron i hanungerne. Det overordnede billede er således at tebuconazol viriliserer hunungerne og feminiserer hanungerne i lighed med prochloraz.

Epoxiconazol har tilsyneladende en vækstfremmende effekt på hanungerne. En højere fødselsvægt af ungerne er sandsynligvis forårsaget af et markant forøget testosteronniveau i moderdyret, der kan tænkes at virke vækstfremmende på ungerne. Dette kan også forklare den umiddelbare tendens til øget AGD i hanfostre og støttes af en ikke signifikant tendens til øget vægt i androgen-afhængige organer i hanunger. Alt i alt tyder resultaterne på at epoxiconazol’ virkningsprofil på hanunger er forskellig fra prochloraz’ og tebuconazols’ virkningsmåde. Stoffet er markant fosterbeskadende og hvilke mekanismer der ligger til grund for denne effekt og om hormonforstyrrelser er en del af årsagen, kan ikke siges ud fra vores forsøg.

Konklusion

Overordnet viser resultaterne fra dette projekt, at azol-fungicider generelt har samme virkningsprofil in vitro, men at virkningsprofilen in vivo er forskellig fra stof til stof. Resultaterne fra in vitro forsøgene viser at alle fire azoler har potentialet til at virke hormonforstyrrende via en række forskellige mekanismer. Potensen af de tre triazoler som indgår i denne undersøgelse: epoxiconazol, propiconazol og tebuconazol var enten lig med eller lavere end imidazolfungicidet prochloraz’ i de anvendte in vitro assays. Propiconazol og tebuconazol udviste ingen AR blokerende virkning in vivo i Hershberger assayet. Til trods for dette var både epoxiconazol og tebuconazol i stand til at medføre effekter på udviklingen af det reproduktive system i afkommet efter eksponering i livmoderen. Både epoxiconazol og tebuconazol inducerede virilisering af hunafkommet, mens tebuconazol også medførte feminisering af hanafkommet. Derudover virkede epoxiconazol generelt fosterbeskadende. Samlet set har de tre undersøgte azolfungicider haft det til fælles at de alle øger drægtighedslængden, de viriliserer hunungerne og de forøger progesteronniveauerne.

Disse effekter kan skyldes at flere virkningsmekanismer, som virker på samme tid, forstærker det samlede biologiske respons. Effekterne på steroidhormonsyntesen in vitro, udeblivelse af effekter i Hershberger assayet (hvor effekter på hormonsyntesen omgås ved at anvende kastrerede, testosteron supplementerede handyr) kombineret med effekterne på udviklingen af det reproduktive system efter perinatal eksponering tyder kraftigt på at en af hovedmekanismerne er forstyrrelse af nøgle-enzymer i steroidhormonsyntese.

De observerede virkninger fortjener videre undersøgelser med henblik på at afdække ved hvilke doser effekterne opstår og for at opnå flere oplysninger om hvilke mekanismer, der er involveret. Resultaterne fra projektet har givet ny viden om azol-fungiciders toksiske virkningsmekanismer og mulige sundhedsmæssige effekter på reproduktionen og det endokrine system og vil derfor kunne bidrage til en bedre risikovurdering for denne meget udbredte gruppe af svampemidler.