Insekticidresistens hos væggelus i Danmark
2 Metodebeskrivelse
2.1 Væggeluspopulationer
2.1.1 Indsamling
Væggelus er over en periode på ca. 2 år blevet indsamlet fra privatpersoner, der har kontaktet Skadedyrlaboratoriets konsultation, eller via skadedyrsbekæmpelsesfirmaer. Det har ikke været så let som forventet at finde passende lokaliteter, hvilket også har betydet, at den geografiske fordeling ikke har været optimal. I de fleste tilfælde er det Skadedyrlaboratoriets personale, der har indsamlet dyrene, men i nogle få tilfælde er dyrene indsamlet af andre og indsendt til laboratoriet. I forbindelse med de fleste indsamlinger er der udfyldt et skema med oplysninger om lokaliteten, om der er behandlet med insekticider, indikationer af hvordan væggelusene kan være blevet introduceret, og hvordan de har påvirket beboerne.
2.1.2 Opformering
Figur 4. "Den kunstige hund".
På trods af, at der i litteraturen er beskrevet metoder til kunstig fodring af væggelus (Montes et al. 2002), har dette ikke kunnet implementeres. Skadedyrlaboratoriet har en såkaldt ”kunstig hund” (Figur 4), som i sin tid blev udviklet til at fodring af kattelopper. Den består af et termostatstyret vandbad, hvorfra vandet strømmer igennem en messingbeholder som derved kan holdes på en bestemt temperatur. I messingbeholderen er der huller til at anbringe glasrør med blod i. Glasrøret lukkes i den ene ende med Parafilm eller Nescofilm og anbringes, med denne ende nedad, ovenpå netlåget til væggelusbeholderen, som væggelusene kan suge blod gennem. Temperaturen skal indstilles således, at temperaturen af blodet holdes mellem 35-37°C, for at væggelusene er interesserede i at suge blod. Blodet, der anvendes, kommer fra nyslagtet kvæg. Som antikoagulant er afprøvet oxalsyre, citrat og heparin. Det har vist sig, at heparin er den bedste antikoagulant til dette formål. Selvom væggelusene gerne vil spise blod med oxalsyre, så dør de af det i løbet af et par dage. Desuden viste det sig, at blodet ikke må fryses ned, som man ellers kan gøre til andre blodsugere, men skal opbevares på køl, hvilket begrænser holdbarheden til 1 uge. På det optøede blod sugede væggelusene en lille smule blod, men tog aldrig et fuldt måltid. Når der blev anvendt blod, som ikke har været frosset, fyldte væggelusene sig helt med blod, nymferne skiftede hud, og der blev observeret æg, som også klækkede. Desværre viste det sig, at der var meget stor variation i, hvor villige væggelusene var til at spise på den kunstige hund. Dette er også observeret i andre undersøgelser (Moore & Miller 2006). Desuden blev der observeret forholdsvis stor dødelighed (10-20% af de individer, der havde indtaget blod). I mindst ét tilfælde var der ekstra høj dødelighed efter en fodring, hvilket muligvis skyldtes rester af insekticider eller medicin (antibiotika) i blodet. Alle væggelus er afhængige af symbionte mikroorganismer for fordøjelse af det indtagne blod (Reinhardt og Siva-Jothy 2007), derfor kan de muligvis ikke tåle antibiotika. Selv meget lave restkoncentrationer af insekticider i blodet vil også være problematisk for væggelusene, som det kendes fra andre insekter (Sommer et al. 2001). Til sidst blev det besluttet at lade væggelusene spise på en frivillig person, og de blev anbragt i små glas med et finmasket net på. Glasset blev holdt mod huden i ca. 30 minutter, hvilket var nok til, at praktisk taget alle havde spist. Derefter var det tydeligt, at populationerne voksede meget hurtigt. Der var dog enkelte populationer bestående af få voksne hunner, som ikke lagde æg og derfor ikke kunne opformeres. Disse dyr blev testet alene.
2.2 Følsomhedstest
2.2.1 Dråbetest
I en dråbetest bliver testmidlet appliceret direkte på dyret i en nøje afmålt mængde. Fordelen ved dråbetest er, at den er let at udføre, og den anvendte mængde gift pr. væggelus kan bestemmes meget præcist. Til gengæld siger den ikke noget om, hvor meget gift dyret selv optager, når det bevæger sig hen over en behandlet overflade.
Vi udviklede og tilpassede en dråbetest metode (Finney 1971), som vi anvender rutinemæssigt til insekter, bl.a. hovedlus (Kristensen et al. 2006). Testen blev udført ved at sætte 1 µl dråber med forskellige koncentrationer af chlorpyrifos eller permethrin i acetone på individuelle væggelus. Væggelusene blev derefter opbevaret i klimarum ved 26°C og 65% relativ fugtighed og antallet af døde væggelus blev opgjort efter 24 og 48 timer. Der blev kun observeret små forskelle mellem 24 og 48 timer data (Appendiks 1 og 2), og vi valgte derfor at arbejde med dødeligheden efter 24 timer. Sammenhængen mellem koncentration af gift og dødelighed (LD = ”lethal dose”) for populationen kunne efterfølgende beregnes ved hjælp af en probit-analyse. På denne måde blev det basalt toksikologiske niveau for chlorpyrifos og permethrin bestemt på en følsomme stamme fra USA, det vil sige det dosisområde, hvor dødeligheden er større end 0 og mindre end 100%.
Da antallet af individer i de indsamlede populationer ikke var store nok til at lave egentlige følsomhedstest med flere doser, blev det besluttet at anvende en diskriminerende dosis til testene. Til det formål blev der anvendt en dosis af permethrin, som var 16 gange LD50 for den følsomme population og for chlorpyrifos på 6 gange LD50. For begge stoffer svarer dette til ca. 2 gange LD99. Disse niveauer er så høje at selv enkelte overlevende individer viser at der er udviklet resistens.
2.2.2 Kontakttest - tarsal eksponering på kommercielle produkter
I en kontakttest afprøves følsomheden over for insekticider som ved en praktisk bekæmpelse. Der vælges én eller flere relevante overflader, der kan repræsentere de overflader eller typer af overflader, som væggelus kan forventes at blive eksponeret på i praksis. Insekterne eksponeres på disse behandlede overflader, og dødeligheden følges i et tidsrum. Formålet med dette er at få et indtryk af, hvorledes en behandling vil virke i praksis, og hvorledes de resistente dyr vil modstå bekæmpelsen.
Det er velkendt, at de behandlede overfladers beskaffenhed kan have en meget stor indflydelse på effektiviteten af et produkt (Vagn-Jensen 1990). Visse overflademidler som lak, maling osv. kan i nogle tilfælde reagere med midlet og dermed ændre koncentrationen af det aktivstof, som insekterne udsættes for. Det kan derfor vise sig, at en relativt lav resistens kan blive forstærket, hvis de behandlede overflader delvist nedsætter et produkts effektivitet. Glas blev valgt til denne forsøgsrække som repræsentant for glatte og hårde overflader, og fordi det udgør en inert overflade, som ikke reagerer med bekæmpelsesmidlet. Da der som tidligere nævnt ikke har været ubegrænsede mængder af væggelus til rådighed, blev det prioriteret bedst at gennemføre de fleste test på glas. Kunne der fremskaffes flere individer fra en given stamme, blev der først foretaget en test på hård masonit, og var der yderligere insekter til rådighed blev der også testet på ubehandlet fyrretræ. Disse to overflader er gode repræsentanter for materialer, der anvendes i møbler, paneler m.m. – steder hvor væggelus ynder at opholde sig.
Til test på glasoverfladerne anvendtes 4 mm vinduesglas på 15 ´ 15 cm. Glasset blev inden forsøget rengjort i en 5% Deconex-opløsning. Til behandling på masonit anvendtes plader på 10 ´ 10 cm, og til test på træ 10 ´ 6,5 cm fyrretræ.
Der blev anvendt 3 velkendte, kommercielt tilgængelige produkter beregnet til bekæmpelse af krybende og kravlende insekter. Produkterne indeholdt henholdsvis 25 % (w/w) deltamethrin (K-othrine SC25), 0,238% permethrin + 0.05% bio-allethrin (Kvit mod myrer) og 20,8% (w/w) mikroindkapslet chlorpyrifos (Empire 20).
Til behandlingen blev K-othrine 25SC-koncentratet og Empire 20 fortyndet med vand, så det gav en dose i overensstemmelse med etiketten ved behandling til ”run off” (en mængde der svarer til, at det vil begynde at løbe af en lodret flade). Ved en fejl blev der kun brugt ca. 25 % af den anbefalede brugskoncentration af Empire 20. På trods af denne fejl fremlægges også disse data, da fejlen ikke har betydning for de væsentligste dele af konklusionen. Permethrin-produktet (Kvit mod myrer) var et ”Klar til brug” produkt, der derfor blev anvendt ufortyndet i den anbefalede dosis.
Doserne af aktivstofferne der blev brugt ved behandlingen var således henholdsvis 19,6 mg deltamethrin pr. m², 57,6 mg permethrin pr. m² (+12 mg d-trans allethrin pr. m²) og 53 mg chlorpyrifos pr. m². De to første doser svarer nogenlunde til de doser, der anbefales til generel bekæmpelse af krybende og kravlende skadedyr med de respektive produkter (15 mg deltamethrin pr. m² eller 48 mg permethrin pr. m² +10 mg d-trans allethrin pr. m²). Hvorimod anbefalingen for chlorpyrifos lyder på 208 mg/m². I alle tilfælde blev vand blev brugt som kontrolbehandling og til fortynding.
Alle overflader blev behandlet ved hjælp af et Potter Precision Spray Tower (Burkard, Rickmansworth, UK). Dette er et sprøjtetårn, der er konstrueret til at overfladebehandle små arealer på ca. 100-200 cm² med en helt præcis mængde sprøjtemiddel udlagt i et helt jævnt lag. Efter at pladerne havde tørret et døgn ved stuetemperatur, blev væggelusene placeret på de behandlede overflader. Der blev brugt 5 voksne væggelus til hver gentagelse, undtagen hvor der ikke var tilstrækkeligt antal dyr i en stamme. I nogle tilfælde blev forsøgene suppleret med nymfer eller blot gennemført med det antal dyr, det var muligt at skaffe. Væggelusene blev eksponeret på overfladerne i 40 minutter hvor dødeligheden blev registreret hvert femte minut. Efter 40 minutter blev dyrene overført til rene bure, og dødeligheden blev registreret efter 2, 4, 24 og 48 timer. Alle væggelus var nyligt blodfodrede.
2.3 Statistisk analyse
Til beregning af letale doser og til fastsættelse af de diskriminerende doser anvendtes en probit-analyse (SAS ver 9.1). På baggrund af en regressionsanalyse relateret til en standard normal fordeling, beregnes de relevante LD værdier. I de tilfælde hvor der var tilstrækkeligt antal doser med dødelighed over 0 og under 100% beregnedes også de tilhørende fiducial limits (grænserne, inden for hvilke en parameter med 95% sandsynlighed forventes at ligge). Disse data danner baggrund for udvælgelsen af de relevante diskriminerende doser og sammenligningerne mellem de enkelte stammers resistensmønster.
I forbindelse med tarsaltestene er det valgt ikke at lave statistiske sammenligninger mellem de enkelte stammer og midler. Dette skyldes, at der langt overvejende er tale om 100% eller 0% dødelighed, hvilket betyder, at der ikke er nogen varians, hvorfor en statistisk sammenligning ikke er mulig.
Version 1.0 December 2007, © Miljøstyrelsen.