3 Resultater

Insekticidresistens hos væggelus i Danmark

3.1 Indsamling og opformering af væggeluspopulationer
3.2 Følsomhed

3.1 Indsamling og opformering af væggeluspopulationer

Der er igennem projektet indsamlet væggelus fra i alt 33 populationer (Tabel 1). På grund af problemerne i starten af projektet med at få væggelusene til at spise, uddøde en del populationer. Antallet af populationer, som er blevet testet, er 20. Derudover er der importeret en population fra USA, som har været i kultur siden 1973, og i denne tid har den så vidt vides ikke været udsat for pesticider. Den betragtes derfor som en følsom referencestamme. Den samme stamme er også blevet brugt som reference i to nyere resistensundersøgelser fra USA (More og Miller 2006, Romero et al. 2007).

Tabel 1. Informationer om populationer indsamlet i projektet. Kolonnen ”Res. test” angiver om populationen blev testet for resistens. Oplysninger mangler om populationerne 2, 11, 14 og 21, som alle var forgiftede eller døde ved ankomsten til laboratoriet.

#	Dato	Post nr.	Res. test	Baggrund /rejser - mulig introduktion	Behandlet	Gener
1	15/2 2005	5700	÷	Fundet på hotel	Vides ikke	Vides ikke
2	1/4 2005	Ikke oplyst	÷	Vides ikke	Vides ikke	Vides ikke
3	12/5 2005	1401	÷	Madagascar jan 05	Nej	Kun 1 person, reagerede ikke meget på bid, rigtig mange dyr
4	5/6 2005	1432	÷	Vides ikke, men beboer siger at der er væggelus i andre huse på Christiania	Nej	Kun 1 person, meget generet af bid, få dyr
5	7/7 2005	2635	÷	Vides ikke, ingen rejser	Nej
6	7/9 2005	2720	÷	Ecuador ca. 6 mdr. tidligere	Nej	Vides ikke, kun 2 dyr fundet
7	16/9 2005	2670	÷	Havde boet i lejligheden i 6 mdr., ingen rejse	Nej	Vides ikke
8	19/10 2005	9260	+	Havde modtaget tæppe fra Iran	Nej	Vides ikke
9	26/10 2005	4200	+	Spanien juli 05	Nej	Vides ikke
10	12/12 2005	8000	+	Vides ikke	Nej	Vides ikke, men der var mange væggelus
11	19/1 2006	Ikke oplyst	÷	Vides ikke	Vides ikke	Vides ikke
12	9/2 2006	2400	+	Marocco feb 05, Polen aug 05, Ungarn dec 05	D-trans allethrin/ Bioresmethrin	1 person i husstand, bidt i en uges tid, men der var rigtigt mange dyr, så de havde været der længe
13	20/2 2006	2620	÷	USA ca. 6 mdr. tidligere, væggelus set siden da	Vides ikke	Par, hvor kvinden var mest generet
14	16/3 2006	?	÷	Vides ikke	Vides ikke	Vides ikke
15	29/3 2006	4600	+	Tenerife dec 05	Nej	Par, hvor kvinden var mest generet, men fandt dyr i begge sider af sengen
16	25/4 2006	2300	+	Frankrig aug 05	Ethanol	Kun 1 person, ikke voldsomt generet, selvom der var mange dyr
17	1/5 2006	6500	+	Vides ikke	Nej	Par, hvor manden var generet
18	16/5 2006	2200	+	Barcelona ca 1 år tidligere, hvor han blev bidt, fortsatte efter hjemkomst; sprøjtet så de forsvandt men er dukket op igen 2 mdr tidligere	D-trans allethrin/ Bioresmethrin 9-10 mdr tidligere	Kun 1 person
19	6/7 2006	9990	+	Vides ikke	Nej	Kun 1 person
20	25/7 2006	2100	÷	Sydspanien aug 05, væggelus set de sidste 1½ mdr.	Vides ikke	Datter og lejer
21	28/7 2006	Ikke oplyst	÷	Vides ikke	Vides ikke	Vides ikke
22	15/8 2006	4600	+	Tenerife jan 06	Permethrin	Børn + mor; et barn reagerer kraftigt, et andet mindre
23	11/9 2006	3700	+	Vides ikke	Nej	Vides ikke
24	12/9 2006	9982	÷	Udlejnings sommerhus	Nej	Lejere
25	18/9 2006	2000	+	Holland mar 06	Nej	Begge (mor+datter)
26	21/9 2006	1879	+	Berlin jun 06, London feb 06; 2 mdr. Tidligere havde der boet en anden person i lejl., som havde haft væggelus	Nej	Kun 1 person
27	20/11 2006	1705	+	Væggelusene havde tydeligvis været der længe	Nej	Kun 1 person, ikke generet, havde haft dem længe
28	17/11 2006	2000	+	Frankrig juni, bidt på hotel	Nej	Kun 1 person, mærker bid men intet udslæt
29	4/12 2006	1718	+	New York juni, bidt på hotel	Nej	Par, hvor kvinden var bidt siden rejse, manden senere. Begge reagerer svagt
30	17/1 2007	2100	+	Sommerferie men ikke set væggelus	Nej	Par, hvor begge bliver bidt, kun kvinden reagerer lidt
31	18/1 2007	2100	+	Hostel i England sommer 06 hvor der var væggelus	Nej	Kun 1 person, reagerer lidt
32	13/3 2007	3550	+	Kreta sommer 06	Nej	Par, hvor kvinden bliver bidt
33	8/5 2007	8370	+	Italien sommer 06	Nej	Vides ikke

3.2 Følsomhed

3.2.1 Basislinie i dråbetest

Det basale toksikologiske niveau for chlorpyrifos hos den følsomme væggeluspopulation (”US”) blev fastlagt eksperimentelt fem gange ved dråbetestforsøg med i alt 226 væggelus (Appendiks 1). Data fra hvert af de 5 forsøg og på de samlede data fra alle forsøg, blev analyseret ved probitanalyse. LD_50, som angiver den mængde gift, der dræber halvdelen af væggelusene i forsøget, varierede mellem 22 og 39 ng chlorpyrifos i de fem forsøg (Tabel 2). LD₅₀ (95% fiducial limits er angivet i parentesen) på de samlede data fra alle forsøg var 30,0 (24,4-35,4) ng chlorpyrifos, og LD₉₅ og LD₉₉ blev beregnet til henholdsvis 70,0 (56,2-101) ng chlorpyrifos og 99,5 (74,8–166) ng chlorpyrifos. På basis af disse resultater blev det besluttet at fastsætte den diskriminerende dosis til 200 ng chlorpyrifos, hvilket svarer til ca. 6 gange LD₅₀ eller 2 gange LD₉₉ (se Figur 5). Dette er en arbitrært fastsat grænse, da der ikke foreligger nogen standard for dette. Med en dosis på 2 gange LD₉₉ kan man være sikker på at eventuelle overlevende dyr skyldes nedsat følsomhed.

Tabel 2. Resultater af probitanalyse af data fra dråbetest med chlorpyrifos på den følsomme stamme "US".

Dato	n	Doser	LD₅₀ (95% f.l.) ng chlorpyrifos	LD₉₅ (95% f.l.) ng chlorpyrifos	Hældning (± SEM)	c² (df)	P>c²
290307	56	6	33,9 (25,7-44,6)	55,7 (42,9-118)	7,6 ± 2.2	0,00 (3)	1,0
200307	60	6	35,0^a	118 ^a	3,1 ± 1,7	0,14 (3)	0,99
270306	30	3	39,1^a	53,6^a	12
270306	50	5	25,3^a	53,7^a	5,0 ± 2,3	5,5 (2)	0,06
300106	30	6	22,4^a	26,3^a	23	0,00 (3)	1,0
Samlet	226	11	30,0 (24,4-35,4)	70,0 (56,2-101)	4,5 ± 0,7	8,3 (8)	0,41

^a Fiducial limits kan ikke beregnes

Figur 5. Sammenhæng mellem dosis chlorpyrifos og dødelighed på den følsomme stamme (’US’). Observerede dødelighed i alle test (hvert kryds markerer resultatet af en test) med den tilhørende probit-kurve. Den blå stiplede linie angiver den diskriminerende dosis.

På tilsvarende måde blev det basale toksikologiske niveau for permethrin hos den følsomme væggelusstamme, fastlagt eksperimentelt fire gange ved dråbetestforsøg med totalt 230 væggelus (Appendiks 2). LD₅₀ varierede mellem 93,8 og 360 ng permethrin (Tabel 3). LD₅₀ (95% fiducial limits er angivet i parentesen) på de samlede data fra alle forsøg var 159 (125-198) ng permethrin, og LD₉₅ og LD₉₉ blev beregnet til henholdsvis 832 (581-1.460) ng permethrin og 1.650 (1.020–3.600) ng permethrin. På basis af disse resultater blev den diskriminerende dosis fastsat til 2.560 ng permethrin, hvilket svarer til 16 gange LD₅₀ eller knap 2 gange LD₉₉ (se Figur 6). Dette er også et arbitrært valg som skal sikre at eventuelle overlevende blandt de feltindsamlede stammer skyldes nedsat følsomhed.

Tabel 3. Resultater af probitanalyse af data fra dråbetest med permethrin på den følsomme stamme "US".

Dato	n	Doser	LD₅₀ (95% f.l.) ng permethrin	LD₉₅ (95% f.l.) ng permethrins	Hældning (± SEM)	c² (df)	P>c²
241006	80	8	93,8 (48,1-150)	768 (412-2.770)	1,8 ± 0,38	2,4 (5)	0,79
010606	60	6	360^a	391^a	45	0,00 (3)	1,0
270306	60	6	125 (67,0-189)	673 (375-3.320)	2,3 ± 0.59	2,9 (3)	0,41
300106	30	6	119^a	166^a	11	0,00 (3)	1,0
Samlet	230	9	159 (125-198)	832 (581-1.460)	2.3 ± 0.30	6.8 (6)	0,34

^a Fiducial limits kan ikke beregnes

Figur 6. Sammenhæng mellem dosis permethrin og dødelighed på den følsomme stamme (’US’). Observerede dødelighed i alle test (hvert kryds markerer resultatet af en test) med den tilhørende probit-kurve. Den blå stiplede linie angiver den diskriminerende dosis.

3.2.2 Indsamlede populationer

Fjorten indsamlede prøver kunne testes i dråbetest for chlorpyrifos-resistens med den diskriminerende dosis: 1 µL 0,02% chlorpyrifos svarende til 200 ng chlorpyrifos pr. væggelus. Kontroldødeligheden, det vil sige dødeligheden af ikke-forgiftede væggelus (N=59), var nul (Appendiks 3). Referencestammen (’US’) blev også testet, og her var dødeligheden 100%.

I fem prøver kunne alle væggelus dræbes med den diskriminerende dosis (Figur 7). I fire prøver døde minimum 80% af væggelusene, og i fire andre lå mortaliteten mellem 50 og 80%. Prøve #23, som dog kun bestod af 3 individer, havde den laveste mortalitet (33,3%).

Figur 7. Resultater fra dråbetest med diskriminerende dosis chlorpyrifos på feltindsamlede væggeluspopulationer og den følsomme stamme ”US”. Tallene over hver søjle angiver antallet af individer i testen.

Tyve indsamlede prøver kunne testes i dråbetest for permethrin-resistens med den diskriminerende dosis: 1 µL 0,256% permethrin svarende til 2.560 ng permethrin pr. væggelus. Kontroldødeligheden var ubetydelig, idet der kun i ét tilfælde (prøve #10) blev observeret en død væggelus i kontrolprøven (N = 50) (Appendiks 4). Ud af 20 individer fra referencestammen (’US’) som blev testet, overlevede en (5%).

I 16 prøver kunne ingen væggelus dræbes med den diskriminerende dose (Figur 8). I prøverne #12 og #19 døde knap 60% af væggelusene, og i prøve #32 blev alle af 6 testede væggelus dræbt.

Figur 8. Resultater fra dråbetest med diskriminerende dosis permethrin på feltindsamlede væggeluspopulationer og den følsomme stamme ”US”. Tallene over hver søjle angiver antallet af individer i testen.

3.2.3 Kontakttest

Resultaterne af tarsaltesten viser nogenlunde det samme billede som i dråbetestene. Generelt er der meget ringe effekt af de to persistente syntetiske pyrethroider, permethrin og deltamethrin (Figur 9 og Appendiks 5). På en af de seks testede feltstammer (#12) var der en vis effekt af både deltamethrin og permethrin, henholdsvis 80% og 29% mortalitet. Den samme stamme var også et af de få eksempler på nedsat følsomhed og ikke fuld resistens i dråbetestene (Figur 8). På trods af den reducerede dosis der blev anvendt, var der en meget høj effekt af den mikroindkapslede chlorpyrifos, idet der i næsten alle tilfælde opnås en fuldstændig dødelighed inden for de første par timer af eksperimentet. Eneste undtagelse fra denne generelle tendens er stamme #31, hvor et enkelt individ først kunne registreres som død efter 2880 minutter (2 døgn).

Figur 9. Dødelighed for de enkelte stammer ved eksponering på A) glas, B) hård masonit og C) fyrretræ behandlet med de forskellige insektmidler. VA = vand, CP = chlorpyrifos, PM = permethrin og DM = deltamethrin.

De få populationer som det var muligt at teste på hård masonit og fyrretræ antyder at permethrin er om end endnu mindre effektivt når det appliceres på hård masonit, idet mortaliteten af den følsomme stamme (US) blev reduceret til 6,7%. Permethrin blev ikke testet på fyrretræ. Af ukendte årsager var kontroldødeligheden af den følsomme stamme forhøjet på både hård masonit (27%) og fyrretræ (40%).