1 Indledning

Bacillus thuringiensis og fødevareforgiftninger

1.1 Baggrund
1.2 Formål

1.1 Baggrund

Bakterien Bacillus thuringiensis er den aktive mikroorganisme i mange plantebeskyttelsesmidler, som anvendes til bekæmpelse af insekter. Den indgår således i ca. halvdelen af de mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler der anvendes i Danmark og i omkring 90 % af de der anvendes på verdensplan. Disse midler udgør såvel mængdemæssigt som økonomisk langt den største del af de mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler på verdensmarkedet.

B. thuringiensis er kendt som et insektpatogen, der er aktiv overfor forskellige typer af insekter. Under sporuleringen producerer bakterien specifikke d-endotoksiner, som er toksiske overfor insektlarver. De specifikke toksiner anses for at være uskadelige overfor mennesker (Glare og O´Callaghan, 2000). Bortset fra de insekt toksiske egenskaber er B. thuringiensis ikke til at skelne fra B. cereus. B. cereus er kendt for at kunne forårsage levnedsmiddelforgiftninger hos mennesker, i form af såvel opkastninger som diarreer. Diareerne skyldes B. cereus evne til at producere en række forskellige enterotoksiner, hæmolysiner og enzymer under deres vegetative vækst i tarmen (Granum, 2001). Generne for disse produkter er kendt og det har derfor været muligt at undersøge hvorvidt stammer af B. thuringiensis er i besiddelse af disse gener ved hjælp af PCR og andre former for genetisk analyse. Sådanne genetiske analyser har vist, at en lang række stammer af B. thuringiensis har egenskaber, som potentielt kan medføre levnedsmiddelforgiftninger (Hansen og Hendriksen, 2001). Det er også blevet vist, at disse egenskaber kan udtrykkes af disse stammer under optimale vækstbetingelser i laboratoriet. Blandt de B. thuringiensis stammer, som har disse potentielt sygdomsfremkaldende egenskaber, er stammer, som indgår i mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler, også midler som anvendes i Danmark (Damgaard, 1996; Wilcks et al., 2006). Men uanset, at anvendelsen af B. thuringiensis har været udbredt i snart mange år, så har den kun været sat i forbindelse med sygdom i nogle ganske få tilfælde og aldrig i Danmark.

Det er imidlertid sådan, at hverken medicinsk praksis eller metoderne der anvendes til at detektere fødevarepatogener skelner mellem B. cereus og B. thuringiensis, som den forårsagende agens, hverken i forbindelse med fødevarekontamineringer eller i forbindelse med fødevareforgiftninger (gastroenteritis) (Granum, 1997; Shinagawa; 1990). Derfor er det ukendt hvorvidt og i hvilket omfang B. thuringiensis har været involveret i fødevareforgiftninger, som er blevet tilskrevet B. cereus. Der eksisterer dog en beskrivelse af et udbrud af gastroenteritis, som involverede fire personer i USA, hvor B. thuringiensis sandsynligvis var involveret. I dette ene tilfælde blev bakterierne initielt identificeret som B. cereus, men senere som B. thuringiensis (Jackson, 1995). Nogle af de tilfælde af levnedsmiddelforgiftninger, der er tilskrevet B. cereus, kan således ikke udelukkes at være forårsaget af B. thuringiensis.

I Danmark er det ukendt, hvor mange fødevareforgiftninger der skyldes B. cereus, og det er også ganske ukendt hvorvidt denne bakterie forekommer almindeligt i vores tarmkanal uden at forårsage sygdom. Når vi ikke kender antallet af fødevareforgiftninger forårsaget af B. cereus skyldes det, dels at der som oftest er tale om lette forgiftninger af 1 til 2 døgns varighed, dels at der ikke foretages en systematisk overvågning af sygdomme forårsaget af denne bakterie. I flere af vores nabolande er det dog dokumenteret, at B. cereus (i denne forbindelse er der ikke blevet skelnet mellem B. cereus, B. thuringiensis og beslægtede arter indenfor gruppen, hvis der ses bort fra B. anthracis) er den bakterie som oftest er involveret i udbrud af gastroenteritis, og samtidig, at dens involvering er betydeligt underestimeret (Ehling-Schultz, 2004). I to undersøgelser har man undersøgt bakteriens forekomst hos ikke syge individer, og fundet den blandt 15-40 % af befolkningen i henholdsvis England og blandt børn i Sydafrika (Ghosh, 1978; Turnbull og Kramer, 1985). Det er ganske ukendt om denne almindelige forekomst af B. cereus blandt mennesker også gælder B. thuringiensis.

Adskillelse af isolater i B. cereus og B. thuringiensis kan ske ved hjælp af mikroskopi efter d-endotoksin krystaller efter vækst på et sporuleringsmedie. Identifikationen af B. thuringiensis kan yderligere blive verificeret ved hjælp af PCR-teknikker rettet mod de plasmidbårne gener som koder for d-endotoksiner.

Med hensyn til B. thuringiensis stammer fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler så kan stammen B. thuringiensis kurstaki HD1 identificeres specifikt (Hendriksen og Hansen, 2006) ved hjælp af krystal-morfologi, PCR for specifikke d-endotoksin- og flagel-gener og RAPD-PCR.

Denne stamme indgår i flere plantebeskyttelsesmidler som finder anvendelse på grøntsager til konsum i såvel ind- som udland f.eks. Dipel, Biobit og Foray (Hansen et al., 1998). B. thuringiensis kurstaki HD1 kan potentielt set forårsage fødevareforgiftninger, da den besidder de nødvendige egenskaber i form af gener for enterotoksiner og hæmolysiner (Hansen og Hendriksen, 2001). B. thuringiensis kurstaki HD1 er desuden blevet fundet på grøntsager til konsum i varierende mængder (Hendriksen og Hansen, 2006; Frederiksen et al., 2006)

Tarmbakteriologsik laboratorium, Afd. for Bakteriologi, Mykologi og Parasitologi på Statens Serum Institut (SSI) modtager ca. 70.000 fæces prøver årligt fra et optageområde som udgør ca. halvdelen af den danske befolkning. Der modtages prøver fra såvel praksislæger som hospitaler. Alle prøver bliver underkastet diagnostik for tarmpatogene bakterier som omfatter: Salmonella, Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Shigella, Vibrio cholerae, Aeromonas, Plesiomonas shigelloides samt Clostridium difficile (kun hospitalsprøver). Ca. 75 % af prøverne underkastes diagnostik for diarrefremkaldende E. coli jf. klinikerens rekvisition. Fæcesprøverne diagnosticeres ikke rutinemæssigt for B. cereus men kun på særlig opfordring fra klinikeren, som har indsendt prøven.

Kun i ca. 10 % af samtlige indkomne prøver kan et bakterielt fund rapporteres. Denne procent sats kan imidlertid variere grundet sæsonvariation: således modtager Statens Serum Institut flere prøver i løbet af månederne juli-august-september samtidig med at forekomsten af tarmpatogene bakterier også stiger mærkbart i løbet af denne periode.

På samtlige fæcesprøver som indgår i nærværende undersøgelse vil man kunne indhente oplysninger om: køn, alder, bopæl (amt/kommune) samt kliniske oplysninger (mistanke til mad indtaget/rejse/underliggende sygdom m.m.) i det omfang klinikeren har redegjort for dette på rekvisitionssedlen.

Siden 2002 har Tarmbakteriologisk lab., SSI i samarbejde med Dansk Zoonosecenter (DFVF) indsamlet fæcesprøver fra raske personer i DK. Disse fæcesprøver (ca. 400 stk.) diagnosticeres løbende for samtlige de ovennævnte organismer dog ikke for B. cereus. Et spørgeskema tilflyder alle personer som har indsendt fæcesprøve til SSI. Dette spørgeskema giver oplysninger om: køn, alder, bopæl (amt/kommune), rejseaktivitet, mave-tarmlidelser, underliggende sygdomme, indtagelse af medicin, hospitalsindlæggelse, indtag af levnedsmidler (kød, fjerkræ, fisk, æg og mælk) samt kontakt til dyr.

Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler skal på lige fod med kemiske plantebeskyttelsesmidler godkendes af de nationale myndigheder i hvert enkelt EU land og skal i den forbindelse gennemgå en risikovurdering. Endvidere skal de aktive mikroorganismer, som indgår i midlerne, vurderes i EU regi. Danmark er ansvarlig for at udarbejde EU risikovurderingen af B. thuringiensis kurstaki. Denne vurdering finder sted i 2006-2007. Det var bl.a. som en forberedelse til denne vurderingsproces, at Miljøstyrelsen ønskede at iværksætte nærværende projekt. Miljøstyrelsen ønskede oplysninger om forekomsten af B. cereus og/eller B. thuringiensis i vores tarmsystem, der kunne belyse hvorvidt forekomsten var udbredt blandt raske danskere uden at dette øjensynligt forårsager diarré. Endvidere ønskede Miljøstyrelsen, at projektet kunne belyse sandsynligheden for hvorvidt de to organismer kan være årsagen til diarré hos danskere. Her var styrelsen især interesseret i hvorvidt B. thuringiensis stammer, der indgår i plantebeskyttelsesmidler, alternativt stammer der forekommer naturligt på overfladen af fødevarer f.eks. grøntsager, kunne være årsag til diarré.

1.2 Formål

Det er projektets formål:

At udvikle og indkøre metoder til at kvantificere forekomsten af B. cereus og B. thuringiensis i fæces fra mennesker, specielt med henblik på B. thuringiensis stammer som anvendes i mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler
At estimere forekomsten af B. cereus og B. thuringiensis i fæces hos raske individer; herunder den eventuelle forekomst af B. thuringiensis stammer fra mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler

Med udgangspunkt i en pilot-undersøgelse at vurdere, om det ud fra et realistisk antal prøver fra patienter med gastroenteritis vil være muligt at identificere mindst 100 fæces prøver med stor forekomst af B. cereus gruppe bakterier. Ønsket om at finde mindst 100 prøver med forekomst af B. cereus gruppe bakterier, er betinget af, at B. thuringiensis kun udgør nogle få procent af de B. cereus gruppe bakterier der findes i miljø-prøver, og det derfor blev vurderet, at det var nødvendigt med mindst 100 prøver for at finde prøver med en stor forekomst af B. thuringiensis.