2 Materialer og metoder

Bacillus thuringiensis og fødevareforgiftninger

2.1 Normal materiale fra raske danskere
2.2 Patient prøver.
2.3 Metoder:

2.1 Normal materiale fra raske danskere

Siden 2002 har Tarmbakteriologisk lab., SSI i samarbejde med Dansk Zoonosecenter (DFVF) indsamlet fæcesprøver fra raske personer i DK igennem flere år. Prøverne er opbevaret i et frysemedie (Okseboullion med

10 % glycerol, SSI Diagnostica). Hele dette materiale er blevet undersøgt, dvs prøver fra 420 personer.

2.2 Patient prøver.

343 tilfældige prøver udtaget fra prøver modtaget mellem d. 8/8 og 5/9 2005 på tarmbakteriologisk laboratorium (se tidligere) er blevet undersøgt. Prøverne er opbevaret i køleskab (4°) og behandlet indenfor et døgn.

Der er udtaget prøver indsendt af såvel læger som hospitaler, og fra såvel voksne som børn.

2.3 Metoder:

To skrabe-prøver fra frysemediet eller to standard skefulde fæces overføres til henholdsvis 2 ml saltvand (SSI Diagnostica) eller til 5 ml filtreret oksebouillon (SSI Diagnostica). De to prøvestørrelser er således ikke identiske; skefuldene er større end skrabene. Det var nødvendigt, at begrænse prøverne fra normalmaterialet til skrab for at undgå at ødelægge prøverne ved optøning.

Oksebouillonen inkuberes natten over.Fra saltvand og bouillon udsåes med podenål på MYP-plader (Oxoid, fremstillet på SSI Diagnostica) (MYP-plader er selektive B. cereus plader, hvor B. cereus kan identificeres ved, at de er røde og at der dannes en hvid udfældning rundt om dem). Saltvand og bouillon gemmes i køleskab (4°C)og der udplades på T3-plader (Travers et al., 1987) så hurtigt som muligt, før og efter varmebehandling af prøverne (30 minutter ved 65°C) (T3-plader er sporuleringsplader, hvor det er muligt at identificere B. cereus-lignende kolonier ved deres morfologi). Alle B cereus-lignende kolonier isoleres og renstryges på T3-plader, dog maksimalt fem fra hver plade. På T3-pladerne bliver kolonierne også talt. Der blev anvendt flere forskellige strategier for at finde de B. cereus lignende bakterier, for at identificere så mange prøver som muligt med bakterierne og for at isolere et stort antal af dem.

Efter renstrygning bliver isolaterne undersøgt ved fasekontrastmikroskopi. Ved mikroskoperingen bliver der især lagt vægt på sporernes størrelse og morfologi, desuden bliver det undersøgt om bakterien producerer d-endotoksin krystaller og eventuelle krystallers morfologi noteres. På basis af sporestørrelse og morfologi afgøres det, om isolatet fortsat må betragtes som værende et B. cereus-lignende isolat.

Fra de isolater, som herefter fortsat bliver betragtet som værende B. cereus-lignende, bliver der herefter oprenset DNA efter vækst på LB-plader. På det oprensede DNA bliver der udført de ni PCR-analyser som fremgår af tabel 1. PCR-analyserne blev gennemført efter afprøvede principper, som beskrevet af Hendriksen og Hansen (2006).

Tabel 1 PCR-analyser gennemført på isolaterne

Analyse	Beskrivelse
ITS	Et sæt generelle primere rettet mod spacer regionen mellem 16S og 23S rDNA generne. Det betyder, at alle bakterier giver PCR-produkter. Produkternes størrelse er til en hvis grad arts-specifik. Analysen bruges her primært til at vurdere kvaliteten af DNAet fra bakterierne, og dets velegnethed til PCR.
Bc-gruppe	Består af to sæt primere rettet mod 16S rDNA generne. Det ene sæt er generelt og giver produkt med alle bakterier. Det andet sæt er specifikt for bakterier indenfor B. cereus gruppen. Analysen bruges til at afgøre hvorvidt et givent isolat tilhører en art inden for B. cereus gruppen.
Cry1	Et sæt primere som generelt er rettet mod gener,som koder for den gruppe af d-endotoksiner som kaldes cry1. Denne gruppe omfatter d-endotoksiner, som er aktive overfor sommerfuglelarver. B. thuringiensis kurstaki HD1 har et af disse gener.
Cry2	Et sæt primere som generelt er rettet mod gener som koder for den gruppe af d-endotoksiner, som kaldes cry2. Denne gruppe omfatter d-endotoksiner som primært er aktive overfor sommerfuglelarver og i et vidst omfang myggelarver. B. thuringiensis kurstaki HD1 har et af disse gener.
Cry3	Et sæt primere som generelt er rettet mod gener,som koder for den gruppe af d-endotoksiner, som kaldes cry3. Denne gruppe omfatter d-endotoksiner som er aktive overfor billelarver.
Cry4	Et sæt primere som generelt er rettet mod gener, som koder for den gruppe af d-endotoksiner, som kaldes cry4. Denne gruppe omfatter d-endotoksiner som er aktive overfor myggelarver.
Cry7-8	Et sæt primere som generelt er rettet mod gener, som koder for de to grupper af d-endotoksiner, som kaldes cry7 og 8. Disse to grupper omfatter d-endotoksiner som primært er aktive overfor billelarver.
Flab1,2	Et sæt primere som er rettet mod gener, som koder for flagellin gener. Dette primersæt binder sig kun til flagellin gener i de to B. thuringiensis serotyper kurstaki og alesti.
RAPD OPA9	Et uspecifikt bindende primersæt, som anvendes til at give et fingerprint af genotypen. Fingerprintet med OPA9 er specifikt for B. thuringiensis kurstaki HD1 og nogle stammer af serotypen aizawai.