Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer
4 Udvælgelse af Enzymer
4.1 Hvad er et enzym?
Enzymer er en type proteinmolekyler opbygget af aminosyrer. Disse proteiner indgår i alle levende celler i mikroorganismer, planter, dyr og mennesker og er en nødvendig bestanddel i alt liv.
Når næringsstoffer i cellen skal omdannes er der enzymer involveret i processerne. Disse næringsstoffer omdannes til energi eller byggesten for cellen ved hjælp af enzymerne i cellerne.
Enzymer virker som biologiske katalysatorer dvs. de indgår i de biokemiske processer i cellerne uden selv at blive forbrugt. Enzymerne bliver derfor genbrugt af cellen.
Der kendes i dag flere tusinde forskellige enzymer. Enzymer kan inddeles i seks hovedgrupper efter virkemåde. For en nærmere beskrivelse af hovedgrupperne se f.eks. ref. 1.
Hovedgrupperne er: oxidoreduktaser, transferaser, hydrolaser, lyaser, isomeraser og ligaser. Hver hovedgruppe har sine specielle funktionelle egenskaber. Enzymerne navngives efter de substrater de omsætter. Således omsætter proteaser proteinmolekyler til byggestenen aminosyre, mens gluco-amylaser vil virke på stivelse og danne glukose som produkt.
I det følgende beskrives enzymer med hydrolytiske egenskaber nærmere. Transformations processen af et substrat til et produkt i en celle kan beskrives ved en ligevægt. (se figur 1 og 2). Illustrationerne med enzymer er brugt med tilladelse fra Novozymes A/S.
 Figur 1 Enzymets aktive del. |
 Figur 2, E + Substrat Produkt + E |
Omsætningsprocessen i en celle af et substrat ved hjælp af et enzym vises i figur 2. Substratet der f.eks. er blevet optaget af cellen omsættes til produkt efter den viste ligevægt. Cellen kan så udnytte produktet til at lave nye byggesten for vækst eller energi.
Enzymer kan også forekomme ekstracellulært, hvor de udskilles aktivt af cellen med det formål at f.eks. nedbryde komplekse organiske forbindelser, som cellen ikke kan optage før de er nedbrudt til mindre organiske molekyler. Det er især mikroorganismer, som udskiller enzymer til sine omgivelser, og enzymer udskilles derfor på naturlig vis til miljøet, men de nedbrydes meget hurtigt af andre organismer. Denne evne hos mikroorganismer til at udskille enzymer udnyttes til industriel fremstilling af enzymer (White, A, et. al. 1973).
4.2 Fremstilling af enzymer
Fremstilling af enzymer til industriel anvendelse foregår ofte ved at dyrke bestemte udvalgte mikroorganismer. Disse mikroorganismer er udvalgt fordi de har nogle enzymer som kan omsætte et substrat til et givet produkt, som man industrielt måtte være interesseret i.
En forenklet fremstillingsproces af et industrielt enzym kan beskrives som følger:
- Mikroorganismerne dyrkes i store beholdere – såkaldte fermentorer - under kontrollerede pH, ilt og temperaturbetingelser.
- Tilsat den rette næring vil mikroorganismerne vokse og udskille enzymmolekyler til det omgivne vandige miljø under ét kaldet kulturvæske. Processen kan sammenlignes med en gæringsproces til f.eks.
fremstilling af vin.
- Efter endt dyrkning filtreres selve mikroorganismen fra kulturvæsken. Denne væske, der nu ikke mere indeholder mikroorganismen, kan nu oprenses yderligere.
Oprensningen kan foregå ved en opkoncentrering af kulturvæsken ved inddampning, udsaltning eller f.eks. ultrafiltrering. Dette foretages for at opnå et mere aktivt præparat, afhængig af enzym samt anvendelsen af enzymet.
Endelig kan præparatet spray-tørres for at få enzymet på pulverform, eller præparatet kan stabiliseres på forskellig vis, hvis enzymet ønskes opbevaret på væskeform.
4.3 Anvendelse af enzymer
Det er ofte enzymer med hydrolytiske egenskaber der er interessante i en industriel sammenhæng. Disse hydrolytiske enzymer indgår i mange kendte processer i dagligdagen.
Der anvendes f.eks. enzymer i opvaskemidler og vaskepulver hvor disse enzymmolekyler nedbryder og dermed frigiver snavset (æg, blod m.m.), og hvor de snavsede partikler så fjernes fra f.eks. tøjet i vaskeprocessen.
Anvendelse af enzymer finder også sted i fødevareindustrien, f.eks. fremstilling af brød, vin, øl, eller fremstilling af sødestoffer udfra stivelse ved hjælp af enzymer (www.novozymes.com).
Fremstilling af ethanol udfra biomasse hvor den dannede ethanol så anvendes i benzinen, er et andet eksempel på anvendelse af enzymer (www.genencor.com).
Enzymer anvendes således til fremstilling af en lang række produkter som indgår i vores dagligdag.
4.4 Anvendelse af enzymer i skibsmaling
Anvendelse af enzymer i skibsmaling er endnu ikke kendt i praksis. På verdensplan er der udtaget relativt få patenter på området som beskriver anvendelse af enzymer som anti-begronings middel.
Anvendelsen af enzymer som anti-begronings middel kan principielt opdeles i to. Indirekte – eller direkte anvendelse.
Den indirekte anvendelse af enzymernes funktion er at omdanne substratet til et produkt. Både enzym og substrat tænkes inkorporeret i skibsmalingen. Produktet som dannes ved den enzymatiske reaktion i malingen eller på dennes overflade, vil så udgøre det egentlige anti-begronings middel i skibsmalingen (Kragh, K., M., Poulsen, Horsmans, Ch., 2000).
Den direkte anvendelse af enzymer er brugen af enzymer til hydrolyse af de klæbestoffer som organismerne udskiller for at hæfte sig fast til overfladen. (Schneider og Allermann, 2000)
4.5 Udvælgelse af enzymer
Ved valg af enzym eller enzymsystem i den direkte anvendelse af enzymer i skibsmalinger skal der fokuseres på de ”klæbestoffer” som organismerne udskiller for at fasthæfte sig.
En vigtig gruppe af marine organismer som signifikant bidrager til fouling processen er den gruppe af crustaceer, som med en samlet betegnelse kaldes rurer.
Disse organismer hører til subklassen Cirripedia og ordnen Crustacea. En fællesnævner for Cirripedia er, at det voksne stadium er fastsiddende på overflader og fjerner sig ikke fra dette sted resten af sin levetid.
Denne fasthæftning forekommer ved at larven - den såkaldte cyprid - svømmer rundt, indtil den finder en overflade, som den kan sætte sig på. Overfladen undersøges nærmere inden larven sætter sig.
Fasthæftningen foregår ved at larven udskiller et klæbestof som udskilles fra første antenne hos larven. Når klæbestoffet er udskilt størkner denne. Larven er nu immobiliseret og undergår en forvandling – metamorfose – til det voksne stadium. Den voksne rur kan nu kun fjernes fra fasthæftningsstedet ved en mekanisk påvirkning.
De klæbestoffer, som marine organismer anvender til at fasthæfte sig med, er undersøgt nærmere i forskellige laboratorier verden over. For rurerne gælder at hovedkomponenten i klæbestofferne er protein.
Valget af enzymer til den direkte anvendelse er således baseret på en (biologisk) forståelse af hvilke forbindelser der indgår i klæbestofferne og hvilke enzymer der naturligt kan nedbryde/hydrolysere disse klæbestoffer.
4.5.1 Enzymers evne til at nedbryde cypriders klæbestoffer
I 1994 er der foretaget undersøgelser hos TNO i Holland der skulle vise om dette biologiske tiltag med hydrolyse af klæbestofferne konceptuelt kunne holde.
Undersøgelserne hos TNO med tre forskellige proteaser viste at det kommercielle enzym Alcalase er i stand til at hindre 100% fasthæftning af cyprider ved en koncentration på 50 - 1000 ug/ml på testplader. Der blev endvidere udført forsøg med højere proteaseaktivitet, hvor også proteasens indvirkning på cypridernes tilstand blev vurderet. Se bilag A.
4.5.2 Forsøg med enzymer og bindemidler
Baseret på ovenstående eksperimenter blev Alcalase valgt som kandidat for yderligere undersøgelser. Alcalasen blev testet for kompabilitet med 7 forskellige bindere som sædvanligvis anvendes i marine malinger ved at teste rest enzym aktiviteten efter 24 timer inkubation ved 36 °C.
De 7 forskellige bindere var: modificeret harpiks, hydrogeneret harpiks, polyvinyl acetate emulsion, polyvinyl methyl ether, polyvinyl klorid copolymer, acrylic harpiks copolymer og silicone binder.
Alcalase blev tilsat og blandet med de ovenfor nævnte bindere ved 4 forskellige enzym koncentrationer (0.25%, 0.50%, 1.0%, and 2%, vægtprocent). De tilsatte mængder enzym blev baseret på tørstofindholdet i binderne.
Konklusionen fra forsøget var at Alcalase aktiviteten er påvirket af bindertypen. enzymaktivitet var tilstede, når denne var sammenblandet med modificeret og hydrogeneret harpiks (rosin), men der kunne ikke konstateres enzymaktivitet ved acryl, silicone samt nogle af polyvinyl bindere.
Det er dog ikke ensbetydende med at enzymer ikke vil kunne virke sammen med disse bindere. Det har blot under de givne forsøgsbetingelser ikke været muligt at detektere enzym aktivitet, sandsynligvis fordi disse bindere giver en meget lukket overfladestruktur. Se bilag B.
4.5.3 Indledende feltforsøg
På baggrund af binderforsøgene planlagdes feltforsøg i havvand for at undersøge effektiviteten af forsøgsmalinger indeholdende Alcalase i kombination med to andre kommercielle enzymprodukter en amyloglucosidase og et xylanase produkt.
To typer af forsøgsmaling indeholdende enzymer blev fremstillet. Malingerne blev benævnt BioB and BioS afhængig af om den var solventbaseret (BioB) eller vandfortyndbar (BioS).
Sandblæste akryl plader malet med de to marine malinger blev monteret på en ramme med 5 x 3 paneler pr. ramme. Rammerne blev nedsænket i havvand i to forskellige havne i Danmark (Jyllinge havn med stillestående vand og Helsingør lystbådehavn med høj vandudskiftning) i 6 måneder år 2000. Rammerne blev placeret på en sådan måde at den øvre del af rammen var ca. 1 meter under havoverfladen.
Evalueringen af disse feltforsøg viste at paneler med BioB indeholdende enzym var kun begroet med få rurer sammenlignet med BioB paneler uden enzym. Det kunne derfor konkluderes at kombinationen af BioB med enzymerne Alcalase og AMG signifikant reducerede fasthæftningen af rurer (sammenlignet med BioB som ikke indeholdt enzym. De to reference prøver indeholdt begge biociderne Irgarol og Diuron, biocider der i dag er forbudte til anvendelse i marine malinger i Skandinavien.
Med hensyn til floraen på panelerne havde BioB panelerne med enzym kun få typer af alger fasthæftet med kisel algen Schizonema som den dominerende, mens kontrol pladerne var fuldstændig overgroet med forskellige typer af alger. Alge foulingen på BioB pladerne med enzym var lette at rengøre idet begroningen let kunne fjernes med en fugtig svamp. Det kan derfor konkluderes at brugen af Alcalase i kombination med AMG/Pulpzyme signifikant reducerer mængden af algebegroning.
Overfladerne af paneler malet med BioB var stadig fuldt intakte efter 6 måneder i havvand. Derimod viste BioS panelerne nogle revner og huller hvor der kunne detekteres begroning. Disse forsøg er mere udførligt beskrevet i bilag B.
4.6 Er enzymer biocider?
Et biocidmiddel er et bekæmpelsesmiddel, der ad kemisk eller biologisk vej ødelægger eller uskadeliggør skadelige organismer eller hindrer virkningen af skadelige organismer (www.mst.dk).
På biocidområdet har EU vedtaget et direktiv, som betyder, at medlemslandene skal indføre fælles regler for vurdering og godkendelse af produkter der indeholder biocider.
De aktive stoffer i biocidprodukter skal godkendes i EU, mens selve produktet godkendes nationalt. I EU's regler er det et væsentligt element, at biocidaktivstoffer ikke kan komme på direktivets positivliste hvis der findes andre stoffer eller metoder, som er tilstrækkeligt effektive og samtidig mindre farlige for sundhed og miljø (www.mst.dk).
Anti-fouling midler er beskrevet i direktivet under hovedgruppe 4, afsnit 21: ”Antifoulingsmidler”.
EU's biocid direktiv har følgende definition på et biocid:
”Aktive stoffer og præparater, som indeholder et eller flere aktive stoffer i den form, hvori de overdrages til brugeren, og som er bestemt til at kunne ødelægge, hindre, uskadeliggøre, hindre virkning af eller på anden vis bekæmpe virkningen af skadegørere kemisk eller biologisk” (EU-direktiv 98/8/EF, 16 Feb. 1998).
Enzymer er som tidligere nævnt en naturlig og nødvendig del for alt liv.
Som beskrevet ovenfor er anvendelse af enzymer i skibsmaling tænkt anvendt på to måder. I den indirekte anvendelse vil enzymerne danne et produkt i skibsmalingen og det er dette produkt der skal tages stilling til om det vil være omfatter af EU biocid direktivets definition.
I den direkte anvendelse af enzymer i skibsmalingen er det ved forsøg understøttet at enzymerne hydrolyserer det klæbestof som f.eks. en rur larve afgiver for at fasthæfte på en overflade og ikke påvirker larven toksikologisk (TNO-report,1994)
4.7 Ophobes enzymer i naturen?
Enzymproteinerne er vandopløselige molekyler samt bio-nedbrydelige. De omsættes derfor i naturen af bakterier og svampe til aminosyrer. Disse aminosyrer optages af mikroorganismerne og omsættes således i økosystemerne til kuldioxid og vand. På det grundlag er det usandsynligt at enzymer kan ophobes i naturen.
4.8 Human toksikologi
Det er kendt at enzymer som alle andre proteiner i naturen i koncentreret form kan give både allergiske reaktioner, og hud, øje eller svælg irritationer.
De allergiske reaktioner adskiller sig ikke fra allergi fremkaldt af græs - eller birke pollen.
EINECS kataloget over kemikalier i EU indeholder mere end 100.000 forbindelser hvoraf mere end 300 er enzymer.
F.eks. er enzymet Alcalase klassificeret i Chemical Abstract Service Registry som en subtilisin, CAS no. 9014-01-1. Det tilsvarende Enzyme Classification no. (International Union of Biochemistry) er EC 3.4.21.62.
Enzymer klassificeres generelt på de færdige produkter med mærkningen Xn og risikovurderingen R42 ”Kan forårsage sensibilisering ved inhalation”.
Dette gælder for non-proteaser og andre proteaser end subtilisinerne, f.eks. Alcalase. Dette protease produkt vil derfor skulle mærkes med Xn (harmfuld), R36 (øje irriterende), R38 (hud irriterende) samt R42 (kan forårsage sensibilisering ved inhalation).
Denne beskrivelse af mærkning vil gælde for de færdige enzymprodukter afsendt fra en enzym producent. Denne mærkning er imidlertid uden betydning, når først enzymet er indlejret i en matrix, som finder sted i færdige enzymprodukter.
I forbindelse med inkorporeringen af enzymer i en skibsmaling vil enzymerne således være bundet til f.eks. en harpiks på samme måde som vi kender det fra et vaskepulver, hvor enzymerne er indstøbt i en voks.
Koncentrationen af enzym i malingen vil endvidere være så lav i det færdige malingsprodukt, at allergiske reaktioner hos slutbruger er usandsynlige.
Version 1.0 April 2004, © Miljøstyrelsen.