| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Kombinationseffekter af pesticider

5 Tokomponent blandinger

• 5.1 Terrestriske planter
  • 5.1.1 Lugtløs kamille
  • 5.1.2 Alm. fuglegræs
  • 5.1.3 Afrunding
• 5.2 Akvatiske planter
  • 5.2.1 Afrunding
• 5.3 Alger
  • 5.3.1 Afrunding
• 5.4 Akvatiske bakterier
  • 5.4.1 Afrunding
• 5.5 Dafnier
  • 5.5.1 Afrunding
• 5.6 Hormonforstyrrende effekter
  • 5.6.1 MCF7 celleprofilerationsassay
  • 5.6.2 AR reportergenassay
  • 5.6.3 Afrunding

I dette kapitel præsenteres og diskuteres resultaterne fra de gennemførte forsøg med tokomponentblandinger. For overskuelighedens skyld vil resultaterne fra hvert testsystem blive præsenteret enkeltvis, mens den sammenfattende diskussion af resultaterne på tværs af testsystemerne vil blive foretaget i kapitel 6.

For hver binær blanding præsenteres ED/EC/IC₁₀ og ED/EC/IC isobolerne. Forsøgene med akvatiske planter og alger er opgjort med et-trins modellen, mens resultaterne fra de øvrige testsystemer er analyseret med to-trins modellen (se kapitel 2). For hver blanding opgjort med et-trins modellen er angivet λ parameteren med standardafvigelse, som er et udtryk for isobolens kurvation, samt p-værdien for F-testen for at isobolen er signifikant forskellig fra ADM isobolen. For de blandinger, som er analyseret vha. to-trins modellen er ligeledes angivet λ parameteren med standardafvigelse samt et interval for p-værdien.

5.1 Terrestriske planter

5.1.1 Lugtløs kamille

Med undtagelse af blandingen af glyphosat og metsulfuron var det muligt at estimere doseringskurver for samtlige herbicider og herbicidblandinger samt at estimere ED₅₀ og ED₁₀ doseringerne. Toksiciteten af de undersøgte herbicider varierede betydeligt med metsulfuron og triasulfuron som de mest toksiske, og mechlorprop og terbuthylazin som de mindst toksiske (op til 3000 gange mindre aktive) (Figur 7). Der blev observeret en forholdsvis stor variation i ED₅₀ doseringerne, hvilket bl.a. kan tilskrives, at forsøgene ikke er udført under standardiserede klimatiske forhold.

Estimeringen af doseringskurvene viste, at det kun i to tilfælde nemlig med blandingerne metsulfuron+triasulfuron samt mechlorprop+MCPA kunne antages, at doseringskurvernes hældning var identisk. Disse to blandinger er netop karakteriseret ved, at de to herbicider har samme virkningsmekanisme, og med baggrund i erfaringerne var tidligere forsøg, var det forventet, at doseringskurverne ville være parallelle (Streibig et al, 1983). Resultaterne med begge disse blandinger afveg meget lidt fra ADM isobolen (Figur 8). At der med samtlige tokomponent blandinger med herbicider med samme virkemåde blev fundet forskellige hældninger af doseringskurverne, understreger, at opdelingen af herbicidblandingerne i 3 grupper er biologisk relevant.

Figur 7. Box-Wiskers plot af ED₅₀ værdier af de 8 pesticider anvendt i forsøgene med lugtløs kamille. Tallene i figuren angiver antallet af uafhængige test.

λ=0.82±0.20 0.37<p<0.62	λ=1.63±0.31 0.06<p<0.28

Figur 8. Estimerede ED₅₀ isoboler samt for blandingerne metsulfuron+triasulfuron og mechlorprop+MCPA, som repræsenterer blandinger af herbicider med samme virkningsmekanisme (den rette linie repræsenterer ADM modellen, mens den buede linie er beregnet på grundlag af de observerede data, som er vist som punkter med standardafvigelse). parameteren med standardafvigelse er et udtryk for isobolens kurvation, mens intervallet for p angiver sandsynligheden for, at isobolen er signifikant forskellig fra ADM isobolen

De estimerede ED₅₀ og ED₁₀ isoboler samt de observerede resultater er vist i Appendiks 1. Vurderet med udgangspunkt i den lave p-værdi blev der for ED₅₀ isobolernes vedkommende kun for 4 af de 16 blandinger observeret signifikante afvigelser fra ADM isobolen. Blandingerne glyphosat+terbuthylazin og glyphosat+mechlorprop udviste antagonisme målt i forhold til ADM, mens mesotrion+terbuthylazin var synergistiske. Anvendes den øvre p-værdi var der ingen af blandinger, der afveg fra additivitet. Diquat+mesotrion udviste så markant antagonisme, at det ikke var muligt at estimere en isobol med to-trins modellen. I figur 9 er vist isobolerne for de ovennævnte 4 tokomponent blandinger.

λ=1.77±0.27 0.02<p<0.17	λ=0.20±0.20 0.001<p<0.07
λ=0.17±0.33 0.01<p<0.14

Figur 9. Estimerede ED₅₀ isoboler samt for de blandinger, som afveg signifikant fra ADM. For blandingen diquat+mesotrion var det ikke muligt at beregne isobolerne. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Målt på ED₁₀ effektniveauet var blandingerne diquat+terbuthylazin, mesotrion+terbuthylazin, glyphosat+terbuthylazin og mechlorprop+terbuthylazin antagonistiske (Figur 10), dvs. 5 af 16 blandinger afveg signifikant fra ADM. Anvendes den øvre p-værdi var ingen af isobolerne signifikant forskellige fra ADM isobolerne. Som tilfældet var på ED₅₀ effektniveauet udviste blandingen diquat+mesotrion så høj et niveau af antagonisme, at det ikke var muligt at estimere isobolen. Det er bemærkelsesværdigt, at blandingen mesotrion+terbuthylazin var antagonistisk på 10% effektniveauet, mens den samme blanding blev fundet at være synergistisk på 50% effektniveauet. En medvirkende årsag til denne forskel var, at hældningen af doseringskurverne for de to herbicider var markant forskellige, idet doseringskurven for terbuthylazin var betydelig fladere end doseringskurven for mesotrion.

λ=0.03±10.7 0.02<p<0.17	λ=0.02±79.7 0.01<p<0.17
λ=0.23±0.27 0.04<p<0.26	λ=0.01±203.3 0.04<p<0.25

Figur 10. Estimerede ED₁₀ isoboler for de blandinger, som afveg signifikant fra ADM. For blandingen diquat+mesotrion var det ikke muligt at beregne isobolerne. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Da man med to-trins modellen ikke kan beregne en eksakt p-værdi men i stedet får angivet et interval, skal ovenstående konklusioner tages med forbehold. En nedre signifikant p-værdi bør kun tolkes som en indikation på signifikante afvigelser fra ADM. En mere rigoristisk vurdering af de opnåede resultater kunne være, at kun i de tilfælde, hvor der både på 10 og 50% effektnivauet er observeret signifikante afvigelser fra ADM, vurderes resultatet at være valid. Anlægger man denne betragtning er det kun blandingerne mesotrion+terbuthylazin og glyphosat+terbuthylazin samt sandsynligvis diquat+mesotrion, som er signifikante forskellige fra ADM, idet alle 3 blandinger var antagonistiske (Tabel 13).

De herbicidblandinger, som afveg signifikant fra ADM på både 10 og 50% effektnivauet tilhørte gruppen af herbicider med samme virkemåde (diquat+mesotrion og mesotrion+terbuthylazin) og forskellige virkemåder (glyphosat+terbuthylazin).

5.1.2 Alm. fuglegræs

I Appendiks 2 er vist samtlige resultater med tokomponent blandinger på alm. fuglegræs. Det var ikke muligt at estimere doseringskurver for blandingen acifluorfen+terbuthylazin. Ligeledes var ikke muligt at estimere ED₁₀ doseringer for blandingen acifluorfen+diquat, og derfor er kun ED₅₀ isobolen vist i Appendiks 2.

Som tilfældet var på lugtløs kamille var metsulfuron og triasulfuron de mest toksiske af de undersøgte herbicider, mens acifluorfen og terbuthylazin var mindst toksiske (Figur 11). Forskellene imellem de mest og mindst toksiske herbicider var mere udtalt over for alm. fuglegræs end lugtløs kamille, idet triasulfuron var ca. 10.000 mere toksisk end acifluorfen. Rangordningen af herbiciderne var imidlertid næsten den samme på de to terrestriske plantearter.

Figur 11. Box-Wiskers plot af ED₅₀ værdier af de 8 pesticider anvendt i forsøgene med alm. fuglegræs. Tallene i figuren angiver antallet af uafhængige test.

Som for lugtløs kamille var det kun med blandingerne metsulfuron+triasulfuron og mechlorprop+MCPA, at hypotesen om ens hældninger af doseringskurver kunne antages. Resultaterne med begge disse blandinger afveg meget lidt fra ADM isobolen (Figur 12).

λ=1.13±0.17 0.44<p<0.66	λ=0.81±0.35 0.58<p<0.76

Figur 12. Estimerede ED₅₀ isoboler samt for blandingerne metsulfuron+triasulfuron og mechlorprop+MCPA. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

På ED₅₀ niveauet er der med udgangspunkt i den nedre p-værdi observeret signifikante afvigelser fra ADM med 5 blandinger: mesotrion+terbuthylazin, glyphosat+mechlorprop, mechlorprop+terbuthylazin, metsulfuron+mesotrion samt metsulfuron+terbuthylazin (Figur 13). Med den øvre p-værdi som reference er der ikke observeret afvigelser fra aditivitet. Med blandingen mesotrion+terbuthylazin er der tale om synergisme, mens de 4 øvrige blandinger alle udviser antagonisme. Med blandingen glyphosat+terbuthylazin er der observeret en markant antagonistisk vekselvirkning, men det var ikke muligt at estimere isobolen og dermed teste hypotesen om afvigelse fra ADM (Figur 13).

λ=2.65±0.38 0.02<p<0.19	λ=0.48±0.21 0.05<p<0.27
λ=0.33±0.26 0.05<p<0.27	λ=0.01±4.99 0.03<p<0.23
λ=0.34±0.28 0.02<p<0.18

Figur 13. Estimerede ED₅₀ isoboler for de blandingerne som afveg signifikant fra ADM. For blandingen glyphosat+terbuthylazin var det ikke muligt at beregne isobolerne. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

I modsætning til ED₅₀ niveauer er der på ED₁₀ niveauet kun i et tilfælde fundet signifikante afvigelser fra ADM, og det var med blandingen metsulfuron+terbuthylazin. Mesotrion+metsulfuron udviser antagonisme, men det var ikke muligt at estimere isobolen og dermed verificere denne antagelse (Figur 14).

λ=0.02±3.65 0.02<p<0.20

Figur 14. Estimerede ED₁₀ isoboler for de blandinger, som afveg signifikant fra ADM. For blandingen mesotrion+metsulfuron var det ikke muligt at beregne isobolerne. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Anlægges samme kriterium som for lugtløs kamille, at der både på ED₅₀ og ED₁₀ niveauet skal være påvist signifikante afvigelser fra ADM, før disse afvigelse kan tillægges nogen vægt, så afviger kun blandingen metsulfuron+terbuthylazin samt mesotrion+metsulfuron, såfremt de markante men ikke statistisk verificerede afvigelser fra ADM på ED₁₀ niveauet med denne blanding medtages. Det betyder, at der er tale om andre blandinger end for lugtløs kamille, og at begge blandinger er karakteriseret ved, at der er tale om herbicider med forskellige virkemåder.

I tabel 14 er resultaterne på terrestriske planter sammenstillet. Sammenfattende kan det konkluderes, at de fleste blandinger ikke afveg signifikant fra ADM, men at der på begge testplanter er observeret enkelte eksempler på antagonisme. Derimod blev der kun observeret synergisme i meget få tilfælde, og altid kun ved et af de to undersøgte effektniveauer, og forsøgene har således vist, at synergi er sjældent, når terrestriske planter eksponeres for blandinger af to herbicider.

Tabel 14.Virkning af tokomponent blandinger på terrestriske planter (lugtløs kamille/alm. fuglegræs). A = additiv virkning; AN= antagonistisk virkning.

5.1.3 Afrunding

Antallet af publikationer omhandlende effekten af blandinger af herbicider over for terrestriske planter er meget stort, som følge af at herbicider er den gruppe pesticider, hvor der i praksis oftest anvendes mere end et aktivstof ad gangen. Blandt de mange publikationer er der imidlertid kun et fåtal, som har haft til formål at beskrive effekterne statistisk, og i de fleste af disse undersøgelser er der anvendt andre statistiske metoder end i nærværende projekt (se Hatzios & Penner, 1985). Ofte er der anvendt den såkaldte Colby metode, som er en forenklet version af MSM metoden, idet kombinationseffekterne som oftest vurderes på baggrund af resultaterne med blot en enkelt dosering af hvert herbicid og herbicidblandingen (Colby, 1967). Det er derfor ikke muligt at sammenholde disse resultater med resultaterne fra dette projekt.

ADM metoden er tidligere brugt til at undersøge effekten af blandinger af herbicider med auxin virkning (Streibig, 1987; Streibig et al, 1998), chlorsulfuron og linuron (Streibig, 1983), MCPA og sulfonylurea herbicider (Mathiassen & Kudsk, 1993), tribenuron og henholdsvis ioxynil+bromoxynil og mechlorprop (Kudsk & Mathiassen 1995), naturlige og syntetiske photosystem II inhibitorer (Streibig et al., 1999) samt herbicider, som påvirker aminosyresyntesen (Kudsk & Mathiassen, 2004). For samtlige disse undersøgelser, som kun omfatter en begrænset antal virkemåder, er der med en enkelt undtagelse enten fundet additivitet eller antagonisme. Resultaterne fra tidligere undersøgelser er altså sammenfaldende med konklusionerne fra dette projekt, men herbiciderne, der er undersøgt i dette projekt, repræsenterer imidlertid mange flere virkemåder.

Med baggrund i i resultaterne fra dette projekt samt tidligere undersøgelser, kan det konkluderes, at tokomponent blandinger af herbicider som hovedregel udviser additivitet eller antagonisme, og at synergisme er et fænomen, som ses meget sjældent.

5.2 Akvatiske planter

De forskellige herbiciders toksicitet overfor Lemna minor varierede med mere end en faktor 100 000. Triasulfuron var det mest toksiske med en gennemsnitlig EC₅₀ værdi på 0,19±0,10 µg L^-1 (n = 2) hvorimod glyphosats EC₅₀ lå på 23316±5165 µg L^-1 (n = 9) (Figur 15).

I Appendiks 3 er vist samtlige resultater med tokomponent blandinger på Lemna minor. EC₅₀ isobolerne er beregnet med et-trins modellen, mens EC₁₀ isobolerne er beregnet vha. to-trins modellen. Isobolen for glyphosat+mesotrion udviste en meget voldsom antagonisme, og denne isobols forløb var derfor bedre beskrevet med Vølunds model. I denne model er afvigelserne fra additivitet beskrevet med de to parametre η1 og η2. Vølunds model er kun anvendt på EC₅₀ isobolerne.

Estimeringen af doseringskurverne viste, at for 3 af de 17 kombinationer (glyphosat+mechlorprop, mechlorprop+terbuthylazin og glyphosat+mesotrion) var hældningerne af doseringskurverne inden for det enkelte forsøg ikke signifikant forskellige fra hinanden. Dvs. at det kun er for disse tre herbicidkombinationer, at interaktionerne på EC₅₀ niveau umiddelbart kan ekstrapoleres til andre effektniveauer.

Figur 15. Box-Wiskers plot af EC₅₀ værdierne for de forskellige herbicider anvendt i forsøgene med Lemna minor. Rækkefølgen på herbiciderne er alfabetisk: 1. Acifluorfen (n = 5), 2. Diquat (n = 7), 3. Glyphosate (n = 9), 4. MCPA (n = 3), 5. Mechlorprop (n = 12), 6. Mesotrion (n = 10), 7. Metsulfuron (n = 9), 8. Terbuthylazin (n = 12), 9. Triasulfuron (n = 2).

λ=0.30±0.1 p=7*10-12	λ=0.58±0.13 p=0.001
λ=0.42±0.27 p=0.006	1λ=3.19±1.57 η2=9.71±0.42 p=0.16

Figur 16. Eksempler på estimerede ED₅₀ isoboler for blandingerne, som afveg signifikant fra ADM. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

De statistiske analyser af EC₅₀ isobolerne viste, at der var antagonisme for 11 ud af de 17 herbicidkombinationer. For de resterende kombinationer var der additivitet. De to kombinationer af herbicider med samme virkningsmekanisme, de to sulfonylurea herbicider metsulfuron og triasulfuron og de to syntetiske auxiner MCPA og mechlorprop udviste begge additivitet. I figur 16 er vist eksempler på herbicidkombinationer, som udviste antagonisme.

λ=0.24±0.17   0.003<p<0.03

Figur 17. Estimerede ED₁₀ isoboler for blandingerne, som afveg signifikant fra ADM. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Et tilsvarende mønster viste sig, når analyserne blev foretaget ved EC₁₀. Afvigelserne fra den additive model for EC₁₀ var dog kun signifikante for 4 af de 17 kurver, når man tæller de 3 kurver med kraftig antagonisme med (acifluorfen+mesotrion, mechlorprop+terbuthylazin og metsulfuron+ terbuthylazin) (Figur 17). Anvendes kun den laveste p-værdi i intervallet, er yderligere 4 kurver forskellig fra additivitet. Af disse udviser to antagonisme på EC₁₀ niveau, hvorimod deres EC₅₀ isoboler ikke var signifikant forskellige fra den additive model. Da der i to-trins modellen anvendes p-intervaller, skal man være forsigtig med konkludere på disse resultater. At antagonisme var mere udbredt på ED₅₀ end på ED₁₀ niveauet kan delvis skyldes, at et-trins modellen, som blev anvendt til analyse af ED₅₀ resultaterne er en mindre konservativ model end to-trins modellen, som er anvendt til analyse af ED₁₀ resultaterne.

I tabel 15 er vist en sammenstilling af resultaterne, hvor der som for terrestriske planter er forudsat, at afvigelser fra additivitet kun er signifikante, såfremt de er observeret på både på 50 og 10% effektniveauet.

Tabel 15.Virkning af tokomponent blandinger på akvatiske planter. A= additiv virkning; AN= antagonistisk virkning.

5.2.1 Afrunding

Der er blevet lavet meget få studier med blandingseffekter på Lemna sp. eller andre højere vandplant (Drost et al., 2003, Frankart et al., 2002), og ingen (udover os (Cedergreen & Streibig, 2005)), har anvendt isobolmetoden. Der er i stedet blevet anvendt enkelte fikserede blandingsforhold, som man har ment har været miljømæssigt relevante. I begge studier har man fundet overensstemmelse mellem resultaterne og den additive model (Drost et al., 2003; Frankart et al., 2002). Dette stemmer godt overens med den overordnede konklusion på de binære Lemna minor forsøg i dette projekt, hvor der ikke blev observeret synergistiske interaktioner med de undersøgte herbicidkombinatiner. I forsøgene i dette projekt var der tværtimod antagonisme for de fleste kombinationer, i nogle tilfælde endda meget kraftig antagonisme.

5.3 Alger

EC₅₀ værdierne for de 7 herbicider, der er undersøgt på alger, er vist i figur 18. Rækkefølgen på herbiciderne er den samme som for Lemna. Det bør bemærkes at for de svage syrer som mesotrion, metsulfuron-methyl og triasulfuron, skulle der næsten 100 gange højere koncentration til at udløse den samme væksthæmmende effekt sammenlignet med Lemna minor.

Figur 18. Box-Wiskers plot af EC₅₀ værdierne for de forskellige herbicider anvendt i forsøgene med algen P. subcapitata. Rækkefølgen på herbiciderne er alfabetisk: 1. Acifluorfen (n = 3), 2. Diquat (n = 4), 3. Glyphosate (n = 3), 4. MCPA (n = 0), 5. Mechlorprop (n = 0), 6. Mesotrion (n = 7), 7. Metsulfuron (n = 6), 8. Terbuthylazin (n = 10), 9. Triasulfuron (n = 5).

Beregningerne af doseringskurverne viste, at for 5 af de 12 kombinationer (mesulfuron+triasulfuron, glyphosat+metsulfuron, glyphosat+terbuthylazin, acifluorfen+diquat samt acifluorfen+mesotrion) var hældningerne af doseringskurverne inden for det enkelte forsøg ikke signifikant forskellige. Alle 3 typer af tokomponent blandinger er repræsenteret blandt de 5 blandinger.

Resultaterne med tokomponent blandinger på alger er vist i Appendiks 4. Resultaterne fra disse forsøg lignede meget forsøgene med Lemna minor, idet der heller ikke her blev fundet synergi men udelukkende antagonisme og additivitet. På EC₅₀ niveau var 9 ud af 12 binære kombinationer signifikant antagonistiske (Figur 19). De 3 blandinger, der udviste additivitet, var metsulfuron+triasulfuron, diquat+mesotrion og metsulfuron+glyphosat, dvs. en blanding med samme virkningsmekanisme, en blanding med samme virkemåde samt en blanding med forskellige virkemåder.

λ=0.88+/-0.12 p=0.32	λ=0.88+/-0.12 p=0.32
λ=0.80+/-0.21 p=0.31

Figur 19. Estimerede ED₅₀ isoboler for blandingerne, som udviste additivitet. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

For blandingen metsulfuron versus terbuthylazin har vi valgt at vise resultaterne fra to forsøg, da det ene forsøg var signifikant antagonistisk, mens det andet forsøg ikke var.

For EC₁₀ isobolerne var fire af de tolv kurver signifikant forskellige fra den additive model. Tre af disse kurver viste så kraftig antagonisme, at de ikke kunne beskrives med Hewlett og Placketts isobolmodel (Hewlett, 1969).

I tabel 16 er vist en sammenstilling af resultaterne, hvor der som for terrestriske og akvatiske planter er forudsat, at afvigelser fra additivitet kun er signifikante, såfremt de er observeret på både på 50 og 10% effektniveauet.

Tabel 16.Virkning af tokomponent blandinger på alger. A = additiv virkning; AN= antagonistisk virkning.

5.3.1 Afrunding

Der er publiceret adskillige forsøg med kombinationseffekter på alger (Faust et al., 2003, Faust et al., 2001, Junghans et al., 2003, Vanwijk et al., 1994). Dette skyldes dels, at alger er en af de standard testorganismer, som er obligatorisk for risikovurdering af en række kemikalier. De mest omfattende studier er blevet udført af Horst Grimmes forskningsgruppe i Bremen. De har i forbindelse med et større EU-projekt (BEAM) analyseret 146 binære kombinationer af diverse kemikalier på alger vha. isobolmetoden (Backhaus et al., 2003, Faust & Scholze, 2004; Grimme & Backhaus, 2003). Denne gruppe har, i lighed med os, fundet, at der sjældent var synergistiske interaktioner i algetesten (Faust et al., 2004). Og når disse blev fundet, var de så små, at man kunne se bort fra dem i en risikoreguleringsmæssig sammenhæng (Faust et al., 2004).

5.4 Akvatiske bakterier

Som følge af, at isobolerne baseret på henholdsvis EC25 og EC₅₀ koncentrationerne var stort set identiske, er kun EC₅₀ isobolerne for Microtox testene vist.

Toksiciteten af enkeltstoffer i Microtoxtesten varierede betydeligt mellem pesticiderne, med chlorfenvinphos som det mest (EC₅₀ = 5.5 0,9 mg l^-1) og pirimicarb som det mindst (EC₅₀ = 688 82 mg l^-1) toksiske (Figur 20). Acifluorfen blev testet dels som rent stof og dels som formuleret produkt, og som forventeligt var effekten af det formulerede produkt væsentligt højere (EC₅₀ = 72,5 mg l^-1) end for det rene stof (EC₅₀ = 244 mg l^-1).

Figur 20. Box-Wiskers plot af EC₅₀ værdier af 7 pesticider anvendt forsøg med to- og trekomponent blandingsforsøg med Microtox. Tallene i figuren angiver antallet af uafhængige test.

Indenfor det enkelte pesticid var variationen i effektkoncentrationen generelt lav og uafhængig af eksponeringstiden (5, 15 og 30 min). Diquat og delvist acifluorfen udgjorde dog en undtagelse med aftagende EC-værdier ved øget eksponeringsvarighed (for diquat var EC₅₀ værdierne henholdsvis 5 min: 261 mg l^-1; 15 min: 52 mg l^-1; 30 min: 39 mg l^-1). Denne egenskab ved diquat gik igen i blandingsforsøgene, idet den tidslige ændring i luminiscenshæmningen øgedes med diquats andel i blandingerne (Figur 21).

Figur 21. Differens i hæmning af luminescens efter 15 og 5 min eksponering som funktion af diquats andel i pesticidblanding. Y-værdien udtrykker differencen af Arctan-transformerede %-hæmninger. F statistik angivet.

En øget hæmning af luminescens med stigende inkubationstiden er karakteristisk for tungmetaller, mens effekten er mindre almindelig for organiske stoffer (Azur 2003).

I Microtox forsøgene blev der beregnet mere end 400 doseringskurver. Anvendes korrelationskoefficienten som udtryk for kurvetilpasningen (logit) og variationen indenfor det enkelte forsøg, var variationen mindst efter 5 min aflæsning og stigende med varighed af eksponering (Figur 22). Anvendelse af regressionsligninger baseret på 5 min eksponering til beregning af effektkoncentrationer må derfor anses som mest velegnede til sammenligning af EC-værdier i blandingsforsøg.

Figur 22. Median og konfidensinterval af regressionskoefficienter i logit doseringsmodeller udviklet på basis af luminescenshæmninger efter 5, 15 og 30 min eksponering. t-test værdi og signifikansniveau for forskel i middelværdi mellem hæmning efter 5 og 15 min angivet.

I blandingsforsøgene er de samme kombinationer af 2 pesticider undersøgt i flere uafhængige test (se tabel 6 og 7). Eksempler på isoboldiagrammer for forsøg med blandinger af diquat-prochloraz er vist i figur 23. I dette eksempel og for de øvrige blandinger, hvor der er gennemført flere test, var der god overensstemmelse mellem resultaterne i de enkelte test. I Appendiks 5, hvor resultater med samtlige tokomponentblandinger er vist, er derfor kun medtaget resultater fra et forsøg med hver tokomponentblanding.

For 5 af de 17 tokomponentblandinger er påvist synergisme, for 7 blandinger var virkningen additiv, mens det ikke kunne afgøres om der var tale om synergisme eller en additiv virkning i 4 blandinger enten pga. forskelligt udfald i de enkelte test , eller fordi der kun forelå én test med usikkert udfald (dimethoat+pirimicarb) (Tabel 17). Med en enkelt blanding var det ikke muligt at afgøre, om der var tale om additivitet eller antagonisme. Det vil sige, at der i modsætning til forsøgene med terrestriske og akvatiske planter samt alger med en enkelt undtagelse ikke er observeret antagonisme.

Et generel mønster var, at virkningen af tokomponent blandinger, hvor pirimicarb eller azoxystrobin indgik, overvejende var additiv. I blandinger med azoxystrobin var standardafvigelsen på EC₅₀-værdierne dog meget store, hvilket var en medvirkende årsag til dette resultat. I blandinger med prochloraz var der synergisme i 3 ud af 6 blandinger og hvor der var synergistisk virkning var denne generelt meget tydelig.

λ=2.69±0.37 0.0008<p<0.055	λ=2.34±0.22 0.0004<p<0.044
λ=2.02±0.39 0.0008<p<0.054	λ=2.0±0.39 0.02<p<0.19
λ=2.16±0.19  0.0008<p<0.055

Figur 23. Estimerede ED₅₀ isoboler for 5 uafhængige test med tokomponent blandinger af diquat og prochloraz. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Tabel 17.Virkning af tokomponent blandinger på akvatiske bakterier (Microtox). A= additiv virkning; AN=antagonistisk virkning; S = synergistisk virkning.

5.4.1 Afrunding

Microtox test er tidligere anvendt i undersøgelser af tokomponent blandingers toksicitet (Chen & Lu 2002 og tidligere referencer). I 18 blandinger blev påvist synergisme i 5 tilfælde, antagonisme i 9 tilfælde og additivitet i 4 tilfælde. Vurdering af interaktion mellem stofferne blev dog ikke baseret på egentlige test som i dette projekt. Med en enkelt undtagelse forekom synergisme, når stofferne havde forskellig virkemekanisme, og det var videre karakteristisk, at stoffer (ét eller begge), som i blanding virkede synergistisk, havde en lav hældning i doseringskurven. Dette forhold var også delvist gældende i nærværende undersøgelse, hvor prochloraz i gennemsnit havde den laveste hældning (1.60.2).

5.5 Dafnier

Da isobolerne baseret på henholdsvis EC₂₅ og EC₅₀ koncentrationerne var stort set identiske, er kun EC₅₀ isobolerne vist for dafnieforsøgene.

Toksiciteten af enkeltstoffer i test med dafnier varierede betydeligt mellem pesticiderne med chlorfenvinphos og esfenvalerat som de mest toksiske og diquat samt prochloraz som de mindst toksiske (Figur 24). Indenfor det enkelte pesticid reduceredes EC₂₅/EC₅₀ værdierne fra 24 til 48 timers eksponering mest udpræget for diquat (3-4 gange reduktion) og mindst udpræget for pirimicarb.

Klik her for at ser Figur 24

Ud af 12 tokomponentblandinger viste 3 blandinger synergi, én antagelig antagonisme, mens 8 blandinger viste additiv virkning (Tabel 18). I figur 25 er vist et eksempel på additiv virkning og et eksempel på synergisme. I Appendiks 6 er vist EC₅₀ og EC₂₅ isobolerne for alle tokomponentblandingsforsøg med dafnier. Det var karakteristisk, at i forsøgene med synergi indgik prochloraz altid, og kun i ét forsøg, hvor prochloraz indgik (i blanding med dimethoat), var der ikke synergistisk virkning (Tabel 18).

λ=1.080.47 0.87<p<0.93	λ=2.540.31 0.0003<p<0.037

Figur 25. Estimerede ED₅₀ isoboler for 2 tokomponentblandinger, som viser additiv (esfenvalerat-azoxystrobin) og synergistisk (azoxystrobin-prochloraz) virkning. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Tabel 18. Virkning af pesticider i tokomponent blandinger på dafnier. A= additiv virkning; AN=antagonistisk virkning; S = synergistisk virkning.

5.5.1 Afrunding

En tidligere undersøgelse af tokomponentblandinger med dafnier viste, at to stoffer med samme virkemekanisme (nonylamin + decylamin) virkede additivt, mens en blanding af to stoffer med forskellig virkemekanisme (ethylparathion + decylamin) virkede antagonistisk (Merino-Garcia et al. 2003). I undersøgelsen blev interaktion mellem stofferne vurderet på basis af isoboler, men en egentlig statistisk test blev ikke udført.

5.6 Hormonforstyrrende effekter

5.6.1 MCF7 celleprofilerationsassay

Oprindeligt var det planlagt at teste 12 forskellige koncentrationer, men da den første testning af enkeltstofferne viste, at der ikke var respons under 0,1 µM, og at der var udpræget cytotoksicitet ved koncentrationer over 25 µM, blev pesticidblandingerne testet i 9 forskellige koncentrationer fra 0.1 til 25 µM. Hver koncentrationsrække indeholdt desuden kontroller, som ikke blev eksponeret for pesticid.

o,p-DDT og endosulfan viste sig at afdampe fra pladerne under inkubering og forurenede de omkringliggende dyrkningshuller på mikrotiterpladen. Alle blandinger og koncentrationer af o,p-DDT og endosulfan er derfor blevet undersøgt på separate mikrotiterplader med 2-hullers afstand mellem de enkelte koncentrationsrækker.

Alle fire pesticider stimulerede koncentrationsafhængigt proliferationen af MCF-7 cellerne som tegn på østrogen virkning (Figur 26). Det var imidlertid kun o,p-DDT og endosulfan, som inducerer et fuldt østrogent respons svarende til det maksimale respons induceret af 17â-estradiol. Methoxychlor og fenarimol inducerer højest et respons svarende til omkring 60% af det maksimale respons for 17â-estradiol. Desuden ses et fald i responset ved 25 µM for de 3 af pesticiderne, hvorfor data for denne koncentration er udeladt fra den videre dataanalyse. Faldet i respons skyldes antageligt en cytotoksisk effekt på cellerne.

Figur 26. Doseringskurver for o,p-DDT, metoxychlor, endosulfan og fenarimol.

Da ikke alle pesticider og blandinger medførte det samme maksimale respons, er de absolutte EC-værdier anvendt til den videre dataanalyse. Det vil sige, at alle anførte EC-værdier er udtrykt i forhold til det maksimale 17-estradiol respons (f.eks. svarer EC₂₅ til den koncentration af det pågældende pesticid eller blanding, som inducerer 25% af det maksimale 17-estradiol respons). EC-værdierne er bestemt direkte ud fra regressionsmodellen ved hjælp af SI-funktionen, som beskrevet af Ritz & Streibig (2004). Isobolerne ved EC₅₀ og EC₁₀ er vist i figur 27 og 28.

λ=0.95+0.10 0.60<p<0.71	λ =0.74+0.20 0.14<p<0.41
λ=0.28+0.35 0.004<p<0.10	λ=0.44+0.24 0.01<p<0.14

Figur 27. Estimerede EC₅₀ isoboler for de 4 undersøgte tokomponent blandinger. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

Isobolerne for tokomponent blandinger af o,p-DDT+methoxychlor og o,p-DDT+endosulfan viste, at de to pesticider virkede additivt ved begge effektniveauer. For de to øvrige blandinger var virkningen (vurderet med udgangspunkt i den nedre p-værdi), additiv eller antagonistisk afhængig af effektniveauet, mens der ikke blev fundet eksempler på synergistiske effekter.

De anvendte blandingsforhold imellem pesticiderne var generelt ikke optimale for beregning af isobolerne, idet der ikke var taget hensyn til forskelle i pesticidernes aktivitet. Det betød, at blandingerne ikke var jævnt fordelt langs isobolen. I forsøgene med trekomponent blandinger blev samtlige tokomponent blandinger gentaget, og i forbindelse med disse forsøg blev blandingsforholdene korrigeret (Appendiks 10).

λ=0.88+0.17 0.46<p<0.60	λ=0.05+21.67 0.05<p<0.26
λ=0.66+0.199 0.07<p<0.30	λ=0.41+0.15 0.001<p<0.063

Figur 28. Estimerede EC₁₀ isoboler for de 4 undersøgte tokomponent blandinger. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre.

5.6.2 AR reportergenassay

For de enkelte pesticider procymidon, fenitrothion og prochloraz ses en antiandrogen effekt i hele koncentrationsområdet, mens der for vinclozolin ses en antiandrogen effekt op til en koncentration på ca. 3 µ M, hvorefter hæmningen forsvinder og der ses en partiel agonistisk effekt (Figur 29). Da det er metabolitterne af vinclozolin, der er de aktive antiandrogene stoffer, kan dette skyldes, at disse metabolitter er partielle agonister ved høje koncentrationer, som det også er observeret for andre kendte antiandrogene stoffer som f.eks. hydroxyflutamid. Overordnet set blev de forventede antiandrogene effekter for enkeltstofferne observeret.

Isobolerne, der afbilder de effekter, der angiver 50% hæmning af det androgen-inducerede respons (IC₅₀ ), ses i figur 30, mens isobolerne beregnet ud fra IC₁₀ er vist i figur 31.

Figur 29. Doseringskurver for vinclozolin, procymidon og blandinger af de to pesticider.

λ = 0.90 ± 0.33 0.75<p<0.86	λ = 1.06 ± 0.28 0.84<p<0.91
λ = 1.64 ± 0.24 0.03<p<0.20	λ = 0.88 ± 0.33 0.71<p<0.88

Figur 30. Estimerede IC₅₀ isoboler for de 4 undersøgte tokomponentblandinger. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre

Overordnet set udviste alle tokomponent-blandinger additivitet ved både IC₅₀ og IC₁₀. Dette gælder også for 2. serie af tokomponentblandinger, som kan ses i Appendiks 11. Dog var der den undtagelse, at blandingen af procymidon og prochloraz gav statistisk signifikant afvigelse fra additivitet (figur 30). Da den samme blanding blev undersøgt i 2.serie i forbindelse med forsøgene af trekomponent blandingerne (se appendix 11), var der klar additivitet. Vi formoder derfor, at afvigelsen skyldes analyseusikkerhed. Alt i alt indikerer resultaterne, at tokomponent blandinger af de undersøgte pesticider virker additivt i det anvendte assay, og at der ikke er nogen interaktion mellem stofferne.

λ = 0.64 ± 1.05 0.67<p<0.81	λ = 1.22 ± 0.54 0.69<p<0.82
λ = 2.08 ± 1.44 0.47<p<0.68	λ = 1.84 ± 0.81 0.32<p<0.69

Figur 31. Estimerede IC₁₀ isoboler for de 4 undersøgte tokomponentblandinger. Se figur 8 for forklaring af isobolerne og statistiske parametre

5.6.3 Afrunding

De opnåede resultater viser samlet set, at tokomponentblandinger af pesticiderne udviser additivitet eller svag antagonistisk effekt i MCF-7 celle proliferationsassayet.

Resultaterne stemmer godt overens med andre in vitro undersøgelser af kombinationseffekter af østrogent virkende stoffer. Således blev blandinger af o,p-DDT, p,p-DDT, p,p-DDE og -HCH påvist at virke additivt vurderet ud fra ADM-modellen i MCF-7 celle proliferationsassayet (Payne et al., 2001). Ligeledes blev der for to-, tre- og firekomponent blandinger af o,p-DDT, genistein, 4-nonylphenol og 4-n-octylphenol testet i et østrogenreceptor (ER) reportergen assay i gærceller fundet additiv virkning, når data blev vurderet både i forhold til ADM- og MSM-modellen (Payne et. al., 2000).

De svage antagonistiske effekter set med blandinger indeholdende fenarimol kan have flere forskellige årsager. Det kan skyldes, at pesticiderne ikke aktiverer ER identisk, idet aktiveringen af ER er meget kompleks og kræver et nøje samspil mellem receptor, ligand og en række cofaktorer. En anden mulighed er en gensidig påvirkning af nedbrydningen af pesticiderne, da MCF-7 cellerne har en vis metabolisk aktivitet. Da fenarimol vides at påvirke en række enzymer (primært cytochrom P450 enzymer) involveret i omsætning af steroider og fremmedstoffer, kan dette være en medvirkende årsag til, at netop blandinger med fenarimol udviser antagonistisk virkning. Især kan det tænkes at have betydning i relation til methoxychlor, hvor det er en metabolit, som er den egentlige ER agonist (Ousterhout et al., 1981). Endelig kan den observerede antagonisme skyldes en cytotoksisk hæmning af MCF-7 cellernes vækst forårsaget af cytotoksiske kombinationseffekter. En sådan mekanisme er foreslået i et studie hvor man ligeledes observerede antagonistiske effekter i blandinger, hvor 4-nonylphenol eller 4-tert-octylphenol indgik (Rajapakse et al., 2004).

I et enkelt studie, hvor andres data fra testning af blandinger i MCF-7 celle proliferationsassayet er blevet genanalyseret ved hjælp af ADM modellen, fandt man tegn på synergistisk virkning for blandinger af o,p-DDT og p,p-DDT (Kortenkamp & Altenburger, 1998). Da genanalysen er foretaget på de publicerede resultater uden adgang til de oprindelige data, er der dog stor usikkerhed forbundet med denne konklusion.

For stort set alle tokomponent blandinger af pesticider testet for androgenreceptor inhibering viste resultaterne et additivt respons. Dette indikerer, at pesticiderne ikke interagerer ved aktivering af receptoren, og at de virker via samme mekanisme. Der er således ikke umiddelbart nogen grund til at tro, at synergistiske eller antagonistiske samspilseffekter for disse antiandrogene pesticider finder sted ved blokering af androgenreceptoren in vitro. Dette understøttes af den viden, vi har opnået i tidligere forsøg med dette in vitro testsystem. Effekten af tokomponent blandinger af vinclozolin og procymidon er tidligere fundet at være additiv in vitro og in vivo (Nellemann et al., 2002; Vinggaard et al., 2004), og den samme additive effekt er fundet for en blanding af pesticiderne deltamethrin, methiocarb, prochloraz, tribenuron-methyl og simazin (Birkhøj et al., 2004).

Generelt understøttes resultaterne vedrørende ER-medieret celleproliferation og AR-inhibering af de øvrige in vitro undersøgelse om kombinationseffekter af kemiske stoffer med samme virkningsmekanisme. Den generelle additive virkning betyder således, at kombination af en række enkeltstoffer, der ikke i sig selv har nogen målelig effekt, kan medføre, at blandingen af stofferne forårsager en målelig effekt, hvilket er i overensstemmelse med, hvad teorien omkring ADM princippet predikterer (Rajapakse et al., 2002; Silva et al., 2002).

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 April 2006, © Miljøstyrelsen.