Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 98 – Kombinationseffekter af pesticider

Kombinationseffekter af pesticider

8 Perspektivering

8.1 Human- versus økotoksikologi
8.2 ADM versus MSM
8.3 Kombinationseffekter af tokomponent og trekomponent blandinger
8.4 Sammenligning af testsystemer

Nærværende projekt er det første, hvor kombinationseffekter af pesticider er blevet undersøgt i forskellige testsystemer, og hvor det primære formål har været at sammenholde resultaterne fra de enkelte testsystemer. Baggrunden for projektet var, at der på trods af en stor interesse omkring effekter af såkaldte "cocktails" af pesticider og andre miljøfremmede stoffer ikke er konsensus om referencemodel og terminologi. Følgelig er det ofte vanskeligt at sammenholde resultater fra forskellige undersøgelser, hvilket også det gennemførte litteraturstudium klart illustrerer. I dette projekt er anvendt samme referencemodel og statistiske tilgang ved analysen af resultaterne fra de 7 testsystemer.

Der er i de senere år hyppigt blevet fremført, at kombinationseffekter af miljøfremmede stoffer burde inddrages i risikovurderingen i erkendelse af, at mennesker, dyr og non-target organismer i de terrestriske og akvatiske miljø ofte vil eksponeres for mere end ét stof ad gangen. En tilsvarende problemstilling gælder for pesticider, som meget ofte udsprøjtes i blanding med andre pesticider. I nyhedsmedierne dukker diskussionen om kombinationseffekter af pesticider og andre "miljøgifte" op fra tid til anden. Ved kombinationseffekter forstås der i denne sammenhæng som oftest uventede høje effekter, eller hvad der med et fagligt udtryk kaldes synergi. Ofte er denne diskussion foranlediget af enkeltstående resultater, som der endvidere ikke altid er statistisk belæg for. På trods heraf drages der ind imellem generelle konklusioner, som typisk peger i retning af, at når der er observeret synergi i ét tilfælde, så kan det ikke udelukkes, at synergi er et mere generelt forekommende fænomen ved samtidig eksponering for to eller flere pesticider.

Selv for en velafgrænset gruppe af miljøfremmede stoffer som pesticiderne, er det i praksis ikke overkommeligt at undersøge effekten af alle relevante kombinationer. Modsat mange andre miljøfremmede stoffer er pesticiders virkningsmekanisme og virkemåde kendt. Udgangspunktet for projektet var derfor at undersøge, om man med baggrund i denne viden kan opstille generelle retningslinier, som vil kunne bruges til at identificere de kombinationer af pesticider, hvor risikoen for synergi er størst. Såfremt det er muligt, vil det være en betydelig mere overkommelig opgave at risikovurdere realistiske anvendelsesscenarier for nye pesticider, herunder at identificere pesticidkombinationer, som potentielt kunne udgøre et problem, og som man derfor kunne kræve undersøgt eksperimentelt.

8.1 Human- versus økotoksikologi

I dette projekt har vi anvendt 5 økotoksikologiske testsystemer, mens vi inden for det humantoksikologiske område kun har inddraget 2 testsystemer. Dette valg var betinget af, at en forudsætning for at kunne gennemføre det store antal forsøg, som var nødvendig for at opfylde projektets mål var, at de anvendte metoder var billige og hurtige. Inden for det økotoksikologiske områder eksisterer der en række metoder, som opfylder disse krav, og som anvendes rutinemæssigt. Det er imidlertid ikke tilfældet inden for det humantoksikologiske område.

Det er i dag almindelig praksis inden for det økotoksikologiske område at vurdere effekten af pesticidblandinger på basis af doseringer, som giver et bestemt biologisk respons. Det er ikke altid tilfældet inden for det humantoksikologiske område, hvor "no observable adverse effect level" (NOAEL) ofte er udgangspunkt for vurderingen af pesticidkombinationer. I et review omhandlende toksikologiske effekter af kemiske stoffer konkluderes det, at ideelt bør udgangspunktet for vurderingen være en dosis, der er associeret med et bestemt biologisk respons, da NOEL er en enkelt punktværdi og ikke et mål for et biologisk respons, og dets størrelse afhænger i høj grad af det eksperimentelle design (FødevareRapport 2003:12). De data, der er tilgængelige for de fleste kemiske stoffer tillader imidlertid ikke altid en estimering af ED doseringer, og relative potenser må derfor baseres på NOAEL som udgangspunkt.

Mens diskussionen indenfor det økotoksikologiske område har være meget fokuseret på valg af referencemodel, så har der indenfor det humantoksikologiske område i højere været en accept af teorien om at "nul plus nul er nul". Dette afspejles hos Cassee et al. (1998) og Feron & Groten (2002), som opsummerede resultaterne af 15 års forskning ved deres institutioner med kombinationer af kemiske stoffer. De konkluderede 1) at kombinationseffekter observeret ved høje doseringer ikke korresponderede med effekter observeret ved lave doseringer , 2) at ADM er en velegnet metode til analyse af blandinger af stoffer med samme virkemåde og 3) at eksponering til ikke-toksiske lave doseringer af blandinger af stoffer med forskellige virkemåder ikke udfør et forøget risiko sammenlignet med eksponering til enkeltstoffer i lave doseringer, dvs. sundhedsrisikoen af sådanne blandinger er bestemt af sundhedsrisikoen af det mest toksiske stof.

I dag er hverken inden for det øko- eller humantoksikologiske område krav om, at ved risikovurderinger af pesticider skal tages hensyn til kombinationseffekter. I den nye EU forordning nr. 396/2005 om maksimalgrænseværdier for pesticidrester i eller på vegetabilske og animalske fødevarer og foderstoffer og om ændring af Rådets direktiv 91/414/EØF er det imidlertid i præamblen nævnt, at det er vigtigt at gøre en yderligere indsats for at udvikle en metodologi, der tager hensyn til kumulative og synergistiske virkninger, og senere i forordningen er det nævnt, at Kommissionen, når den fremsætter forslag om maksimalgrænseværdier, bl.a. skal tage hensyn til stoffernes kumulative og synergistiske effekter , når der findes metoder til vurdering af sådanne virkninger (artikel 14, stk. 2).

Det har været foreslået at anvende et såkaldt "hazard index", som er lig summen af eksponeringen af de enkelte pesticider i forhold til deres respektive ADI (E1/ADI1+E2/ADI2 ....), som udgangspunkt for vurderingen af f.eks. pesticidblandinger. Hvis stofferne i blandingen har samme virkningsmekanisme bør TEF (Toksikologiske Ækvivalens Faktorer) i stedet benyttes, hvilket i princippet svarer til anvendelsen af ADM modellen (Refftstrup, 2002). Fødevarestyrelsen konkluderede i sin rapport (FødevareRapport 2003:12), at rigid anvendelse af en enkelt, særligt udvalgt metode til risikovurdering af alle blandinger af kemiske stoffer ikke kunne anbefales. Det blev foreslået, at fremgangsmåden beskrevet af Reffstrup (2002) kunne bruges til vurdering af relativt simple blandinger af pesticidrester i fødevarer, mens andre metoder burde foretrækkes, når der er tale om mere komplekse blandinger (Groten et al.2001 og ATSDR 2002).

8.2 ADM versus MSM

Sideløbende med nærværende projekt blev der som led i et EU projekt (BEAM) udført en række undersøgelser med multikomponentblandinger af kemiske stoffer med identiske eller forskellige virkemåder af to forskergrupper ved universiteterne i henholdsvis Bremen og Leipzig. Et af de primære formål med dette projekt var at undersøge, hvilken af de to referencemodeller, ADM og MSM, som mest præcist kunne prediktere effekterne af multikomponentblandingerne undersøgt primært på alger men også akvatiske bakterier, dafnier og fisk. Forsøgene viste, at ADM modellen var bedst til at beskrive effekten af blandinger af kemiske stoffer med samme virkemåde, mens MSM som oftest beskrev blandinger af kemiske stoffer med forskellige virkemåder mere præcist (Altenburger et al., 2000; Backhaus et al., 2000; Drost et al., 2003; Faust et al., 2001; Faust et al., 2003; Junghans et al., 2003b; Junghans et al., 2003a). Som oftest predikterede ADM en større effekt af multikomponentblandingerne end MSM, men for blandinger af stoffer med en meget flad doseringskurve kunne forholdet være omvendt, eller også var der ikke forskel på de to referencemodeller prediktioner (Faust & Scholze, 2004). Generelt var forskellen mellem de to referencemodeller uden praktisk betydning i en risikovurderingssammenhæng, og derfor anbefalede forfatterne, at ADM burde anvendes som referencemodel ved en fremtidig risikovurdering af blandinger af miljøfremmede stoffer. Det skal bemærkes, at tidligere undersøgelser af de samme to forskergrupper med tokomponentblandinger ikke viste samme entydige sammenhæng. Tværtimod fandt man, at ADM generelt beskrev effekten af binære blandinger bedre end MSM (Faust et al., 1993, 1994, Grimme et al., 1996).

I nærværende projekts første fase blev samtlige resultater med tokomponent blandinger på terrestriske og akvatiske planter samt alger analyseret vha. af både ADM og MSM. I alle tilfælde predikterede ADM en højere effekt end MSM, hvilket kan forklares med, at ingen af de undersøgte herbicider havde så flade doseringskurver, at MSM kunne forventes at prediktere højere effekter end ADM.

Dette er illustreret i figur 44 for 4 udvalgte tokomponentblandinger på alm. fuglegræs og lugtløs kamille, hvor MSM i alle tilfælde predikterede en lavere effekt end ADM. Af figur 44 kan endvidere ses, at det faktum, at ADM i de fleste tilfælde predikterer højere effekter af pesticidblandinger end MSM, betyder, at synergi vil være hyppigere forekommende, hvis MSM anvendes som referencemodel, mens antagonisme vil være mere sandsynlig, når ADM anvendes. De 4 blandinger i figur 44 illustrerer dette forhold. Blandingen glyphosat+terbuthylazin udviste så stor grad af antagonisme, at uanset hvilken referencemodel, der er anvendt, vil konklusionen være, at denne blanding er antagonistisk. Modsat forholder det sig med blandingen diquat+terbuthylazin, hvor responset var, som predikteret med MSM, mens der i følge ADM var tydelig antagonisme. Blandingerne mesotrion+mechlorprop repræsenterer et eksempel på en blanding, som i følge MSM er synergistisk, men som følger ADM og derfor vurderes som værende additiv. Mesotrion+terbuthylazin eksemplificerer et eksempel på en blanding, som er synergistisk i følge både ADM og MSM.

Klik her for at se Figur 44

Anvendes ADM som referencemodel ved risikovurdering af pesticidblandinger vil der være færre situationer, hvor effekten undervurderes, end hvis MSM anvendes. Spørgsmålet er så, om ADM kan betragtes som et slags "worst-case" scenario, eller om der vil være blandinger, som resulterer i større effekter end predikteret med denne model, og om disse blandinger kan identificeres på grundlag af et kendskab til pesticidernes virkningsmekanisme/virkemåde. Dette spørgsmål er søgt besvaret i dette projekt.

En fordel ved ADM frem for MSM metoden er, at man med kendskab til ED/EC₅₀ værdierne for de enkelte pesticider samt nogle antagelser omkring doseringskurvens form er i stand til at vurdere, om det er sandsynligt, at blandinger af disse pesticider vil resultere i utilsigtede effekter. Cedergreen et al. (2003) har vist, hvordan ADM modellen kan bruges til at vurdere effekterne af pesticidblandinger.

8.3 Kombinationseffekter af tokomponent og trekomponent blandinger

Med tokomponentblandinger af pesticider med samme virkningsmekanisme blev der i alle testsystemer fundet en klar indikation på, at effekten af disse blandinger kunne predikteres vha. ADM, og der blev ikke observeret entydige synergistiske effekt med nogen af de 20 undersøgte kombinationer.

Tokomponentblandinger af pesticider med samme virkemåde men forskellige virkningsmekanismer blev kun undersøgt på terrestriske og akvatiske planter samt alger. I de fleste tilfælde fulgte blandingerne ADM, men der blev også observeret antagonisme. Synergi blev ikke observeret med nogen af de 6 blandinger. Resultaterne på terrestriske og akvatiske planter samt alger med tokomponentblandinger af pesticider med forskellige virkemåder var identiske med resultaterne med blandinger af pesticider med samme virkemåde og forskellige virkningsmekanismer, idet der i intet tilfælde blev observeret synergi. I testsystemerne med akvatiske bakterier og dafnier blev der observeret et noget andet mønster, idet additivitet og synergi var de mest almindelige respons, mens entydige antagonistiske respons ikke blev observeret. Synergi var i vid udstrækning knyttet til tilstedeværelsen af prochloraz, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser.

Sammenfattende kan det konkluderes, at der i forsøgene med tokomponent blandinger kun er observeret meget få tilfælde, hvor effekten af tokomponentblandinger var højere end den forventede effekt i følge ADM. Konkret er der i dette projekt undersøgt 101 forskellige kombinationer af pesticidblandinger og testsystemer. Hovedparten af disse blandinger fulgte ADM, og kun i 8 tilfælde er der fundet et entydigt synergistisk respons. I disse tilfælde varierede de estimerede λ værdier mellem 2 og 3, dvs. der med en 50:50 blanding er opnået f.eks. 50% effekt med fra 25 til 50% af den i følge ADM forventede dosering.

Det faktum, at der er observeret signifikante synergistiske effekter i forhold til ADM, betyder, at ADM ikke umiddelbart kan anvendes som et " worst case" scenario, men at ADM f.eks. må kombineres med anvendelse af en sikkerhedsfaktor, som også tidligere påpeget af Faust & Scholz (2004).

Antagonisme blev observeret med 14 af de 101 blandinger. I de tilfælde, hvor det var muligt at estimerede λ værdier, varierede disse fra 0.20 til 0.58, dvs. den observerede antagonisme svarede til, at det det var nødvendigt at øge doseringen af de to pesticider i en 50:50 blanding med fra 34 (21-0.58) til 74% (21-0.2). I de tilfælde, hvor det ikke var muligt at estimere λ, eller hvor model 3 blev anvendt, var graden af antagonisme endnu større.

Trekomponent blandingerne var sammensat med udgangspunkt i resultaterne med tokomponent blandinger. Baggrunden var, at formålet med disse forsøg var at undersøge, om det var muligt at prediktere effekten af trekomponentblandinger med baggrund i et forhåndskendskab til effekten af tokomponentblandinger.

Det var hverken på terrestriske eller akvatiske planter muligt at identificere noget mønster imellem de respektive tokomponent blandingers respons og trekomponent blandingens respons. En tilsvarende konklusion kunne drages vedrørende MCF7 celleproliferations- og AR reportergenassayene. I modsætning til terrestriske og akvatiske planter, så syntes effekten af trekomponent blandinger på akvatiske bakterier i højere grad at kunne predikteres ud fra en viden om tokomponent blandingernes virkning. Om det generelt er tilfældet i dette testsystem eller primært er knyttet til trekomponent blandinger, hvor der er observeret synergi er ikke muligt at afgøre på grundlag af de foreliggende resultater.

Sammenfattende kan det konkluderes, at med undtagelse af når prochloraz indgik i trekomponentblandinger på akvatiske bakterier, så var det ikke muligt, med udgangspunkt i de respektive tokomponent blandingers respons, sat drage nogen entydige konklusioner vedrørende trekomponent blandingers respons. Med undtagelse af de blandinger, som er undersøgt i MCF7 celleproliferationsassayet og AR reportergenassayet, repræsenterer alle undersøgte trekomponent blandinger eksempler på blandinger af pesticider med forskellige virkemåder. Såfremt denne type blandinger beskrives bedre med MSM end med ADM ville man forvente antagonisme, når ADM anvendes som referencemodel. Det er imidlertid ikke tilfældet, idet mange af de undersøgte trekomponentblandinger virkede additivt eller synergistisk, dvs. de heller ikke fulgte MSM. Det kan derfor konkluderes at ADM også synes at være en mere velegnet referencemodel end MSM ved vurdering af kombinationseffekter af trekomponent blandinger af pesticider.

Svaret på spørgsmålet om, hvorvidt ADM kan betragtes som et slags "worst-case" scenario, er derfor et ja, idet projektets resultater har vist, at denne model kun meget sjældent undervurderede effekten af tokomponent blandinger. Som et værktøj til risikovurdering af tokomponent blandinger er ADM derfor mere velegnet end MSM modellen uagtet.

8.4 Sammenligning af testsystemer

Med undtagelse af forsøgene på terrestriske planter anvendes de øvrige økotoksikologiske testsystemer rutinemæssigt ved vurderingen af pesticiders økotoksikologiske effekter. MCF7-celleproliferationsassayet og AR reportergenassayet er forholdsvis nye test, som endnu ikke anvendes rutinemæssigt ved vurdering af de humantoksikologiske effekter af pesticider. I nogle af testsystemerne er der anvendt de samme pesticidblandinger for at kunne vurdere i hvor stor udstrækning resultater i et testsystem kan ekstrapoleres til andre testsystemer. Af speciel interesse er sammenligningen mellem terrestriske og akvatiske planter og til dels også sammenligningen mellem disse to testsystemer og alger. At førstnævnte sammenligning er interessant skyldes, at der i fremtiden forventes, at der vil blive stillet krav om dokumentation af effekten af pesticider på terrestriske non-target planter, hvilket ikke er et krav i dag.

En sammenligning af resultaterne med de samme herbicidblandinger på lugtløs kamille, alm. fuglegræs og Lemna minor viser en meget stor grad af overensstemmelse. Med 11 og 13 af de i alt 17 herbicidblandinger er der fundet identiske respons på henholdsvis lugtløs kamille og Lemna miror og alm. fuglegræs og Lemna minor. I ingen af de øvrige tilfælde er der observeret diametralt modsatte resultater, dvs. henholdsvis antagonisme og synergisme. Det betyder, at resultater med tokomponentblandinger fra forsøg på akvatiske planter vil kunne danne grundlag for en vurdering af kombinationseffekter på terrestriske planter og omvendt. Dette resultat er lidt overraskende, da rangordningen af de undersøgte herbicider over for terrestriske planter er forskellig fra rangordningen over for Lemna minor (Figur 7 & 15). Endvidere er de absolutte forskellene imellem de mest og mindst aktive herbicider større på Lemna minor (en faktor 100.000) end på terrestriske planter (en faktor 1000), hvilket betyder, at forholdet imellem herbiciderne i mange af de undersøgte blandinger har været forskelligt.

Der blev ligeledes fundet en forholdsvis god overensstemmelse mellem terrestriske planter og alger, idet responsen af 9 og 7 af de i alt 12 herbicidblandinger var identiske på henholdsvis lugtløs kamille og alger og alm. fuglegræs og alger. Der var dog typisk tale om andre herbicidblandinger end for terrestriske og akvatiske planter, hvilket afspejler, at der var en forholdsvis dårlig overensstemmelse mellem resultaterne med akvatiske planter og alger. Modsat højere planter er alger encellede organismer, og algers respons over for herbicider kan være meget forskelligt fra planters. Det gælder f.eks. over for phenoxysyre herbiciderne, der påvirker kommunikationen mellem cellerne i højere planter. Phenoxysyrers aktivitet er meget lavere overfor alger end over for planter. At potensen af svage syrer som metsulfuron og triasulfuron i forhold til neutrale herbicider som terbuthylazin er meget lavere for alger end for Lemna minor afspejler, at dyrkningsmediets pH, som var 5 i Lemna minor testen og 8 i algetesten, har stor indflydelse på optagelsen af svage syrer (Figur 15 & 18).

Som det var tilfældet med terrestriske og akvatiske planter samt alger, så er der ligeledes undersøgt en række identiske pesticidblandinger på akvatiske bakterier og dafnier. Generelt er der fundet en meget stor overensstemmelse imellem resultaterne i disse to testsystemer, idet det kun med én af de 8 blandinger (dimethoat+prochloraz) er fundet forskellige respons, hvilket tyder på, at det i vid udstrækning er muligt at ekstrapolere imellem disse to testsystemer mht. pesticidblandingers respons.

I de to testsystemer, der anvendes til vurdering af kemiske stoffers hormonforstyrrende effekter, er der anvendt forskellige pesticidblandinger, da det blev prioriteret at udvælge nogle af de mest potente pesticider i hvert testsystem.I begge testsystemer er der overvejende observeret additive effekter, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. At der med et enkelt pesticid er observeret antagonistiske respons i MCF7 celleproliferationsassayet er ligeledes i overensstemmelse med nyere resultater fra andre studier (Rajapakse et al., 2004).

Sammenfattende kan det konkluderes, at det ved vurdering af kombinationseffekter af pesticider synes muligt at ekstrapolere imellem sammenlignelige testorganismer og testsystemer, i dette projekt eksemplificeret ved terrestriske planter/akvatiske planter/alger, akvatiske bakterier/dafnier og MCF7 celleproliferationsassayet/AR reportergenassayet.