(b)

Figur 1-2
Microcystis arter (a) og Anabaena arter (b). Microcystis og Anabaena er to af de almindeligst forekommende toksinproducerende blågrønalgeslægter i danske søer.

1.1 Effekter af blågrønalgetoksiner

Forgiftningstilfælde som følge af blågrønalger er kendt i hele verden, og forgiftninger af mennesker og kvæg er beskrevet allerede i forrige århundrede (Farre 1844 i Schwimmer & Schwimmer 1968, Francis 1878). I Danmark er der gennem de sidste 15 år jævnligt observeret ildebefindende hos kvæg (krampe og kalvekastning) og dødsfald hos hunde samt fisk og fugle, der har drukket søvand med opblomstringer af blågrønalger (Damsø et al. 1994).

I modsætning til f.eks. Norge og Sverige har vi i Danmark endnu ikke veldokumenterede rapporter om effekter af blågrønalger på mennesker. En væsentlig årsag til dette kan være manglende opmærksomhed og manglende viden. Koblingen mellem sygdomssymptomer og blågrønalger må oftest ske indirekte ved at kombinere viden om forekomst af blågrønalger, forekomst af toksiner, effekt af toksiner og sygdomsbillede. Hyppigt inddrages blågrønalger først som en mulig årsag, når alle andre forklaringer er udelukket.

Badevand
Rødme og udslet

Hudinflammationer (rødme og udslet) hos mennesker, der har badet i søer med blågrønalgeopblomstringer, er almindelig kendt i udlandet (Annadotter 1993, Carmichael et al. 1985, Codd & Bell 1985). I Sverige er der i en række tilfælde observeret høfebersymptomer som snue, rindende øjne og astma hos badende, der har været i kontakt med blågrønalgeopblomstringer (Heise 1949, Heise 1951, Annadotter 1993). Det er usikkert, om der er tale om en direkte toksisk effekt, eller om inflammationerne og høfeberen skyldes allergi mod algerne.

Tabel 1-1

Mavetarmkatar
Normalt vil mennesker ikke, som f.eks. kvæg og hunde, indtage så store mængder søvand, at det får lethale effekter. Der er imidlertid flere eksempler på, at mennesker er blevet dårlige efter at have drukket mindre mængder søvand med blågrønalger. I Canada blev 11 børn og et par voksne syge efter trods advarsler i aviser og TV at have badet i søer med kraftige algeopblomstringer (Dillenberg 1960). Symptomerne var mavesmerter, diarré, opkastninger, feber og hovedpine. I faeces fra de syge blev der fundet celler af blågrønalger, mens der ikke var spor af patogene bakterier eller virus. I 1989 blev engelske rekrutter sendt på øvelse på en sø med opblomstring af blågrønalgen Microcystis aeruginosa, og 10 af rekrutterne, der drak søvand, fik bagefter pneumonia (lungeinflammation) foruden feber, mavekrampe, opkastning m.m. (Turner et al. 1990). Heller ikke i dette tilfælde blev der fundet patogene bakterier eller virus, der kunne forklare sygdomsudbrudene.

Lungeinflammation
I Danmark er kraftige blågrønalgeopblomstringer almindelige om sommeren i mange af vore badevandssøer, som f.eks. søerne i Mølleåsystemet og Gudenåsystemet, og advarsler mod badning forhindrer normalt ikke folk i at bade i søerne. Når der ikke er rapporteret patogene effekter skyldes det sandsynligvis, at symptomerne ligner almindelig bakterie/virus infektion, samt at de normalt forsvinder hurtigt (indenfor 1-2 dage) og kun rammer særligt følsomme personer. I mange tilfælde vil folk derfor ikke søge læge, og hvis de gør, vil lægen ikke sætte symptomerne i forbindelse med forekomst af blågrønalger.

Drikkevand
En hyppig årsag til blågrønalgeforgiftninger er indtagelse af toksiner med drikkevandet. I Danmark bruger vi kun i begrænset omfang overfladevand fra søer til drikkevand. Således udgør søvand på årsbasis ca. 4-18% af drikkevandet. Indvindingen foregår hovedsageligt i hovedstadsområdet, og overfladevandet opblandes med grundvand, så det aldrig udgør over 50%. Til sammenligning kommer 75% af den svenske vandforsyning fra søer (Annadotter 1993), og i Finland er andelen 48% (Lepistö et al. 1994). Sandsynligheden for toksiske effekter på mennesker er derfor langt mindre i Danmark.

I lande, hvor drikkevandet er baseret på ferskvandsindvinding, kan der opstår epidemier, hvor større befolkningsgrupper rammes (se tabel 1-2). I Australien oplevede man i 1991 den hidtil største blågrønalge"katastrofe" i verden. Blågrønalgen Anabaena circinalis dannede en kraftig opblomstring over en mere end 225 km lang strækning af Darling flodsystemet, der bruges til drikkevand. Algen producerede både lever og nervetoksiner, og indtagelse af algeholdigt vand medførte at folk blev syge, og kvæg, får og hunde døde. Området omkring floden blev erklæret for katastrofeområde, og militæret blev indsat for at bringe rent vand ud.

På Palm Island blev 148 mennesker syge efter at have drukket vand, der stammede fra et vandreservoir domineret af Cylindrospermopsis raciborskii. Der var få dage forinden blevet tilsat kobbersulfat til søen for at regulere en kraftig algeopblomstring. Ved tilsætning af kobbersulfat dør algerne, og eventuelle toksiner frigives (Hawkins et al. 1995).

Mavetarm katar /Barcoo fever
En almindelig følge af blågrønalgeforgiftning efter indtagelse af forurenet drikkevand er mavetarmkatar (Annadotter 1993, Tabel 1-2). I Australien er der desuden konstateret sygdomstilfælde med effekter på leveren hos mennesker, der får drikkevand fra damme/søer med masseopblomstringer af blågrønalger (Bourke et al. 1983, Falconer et al. 1983a). Ligeledes fra Australien er det foreslået, at en sygdom beskrevet som "Barcoo fever" kan skyldes indtagelse af blågrønalgetoksiner (Hayman 1992). Sygdommen er karakteriseret ved feber, hovedpine, kvalme, opkastninger og kraftig diarré; symptomer som hyppigt er rapporteret i forbindelse med indtagelse af vand med blågrønalger (Schwimmer & Schwimmer 1968, Billings 1981, Turner et al. 1990, Annadotter 1993, Saadi & Cameron 1993).


Tabel 1-2
Sygdomstilfælde forårsaget af blågrønalger i drikkevand forskellige steder i verden

Badfeber
Den såkaldte badfeber er et andet sygdomsbillede, som menes at skyldes blågrønalgetoksiner i hanevand. De ramte personer får influenzalignende symptomer med feber få timer efter, at de har været i bad. I Sverige og Finland er der gennem de sidste 20 år konstateret flere epidemier af badfeber (Annadotter 1993). Rylander et al. (1989) konkluderer, at epidemierne skyldes indånding af endotoksiner, og at disse toksiner stammer fra blågrønalger, fordi der er en tæt sammenhæng mellem forekomsten af epidemier og opblomstringer af disse alger.

Dødsfald
I enkelte tilælde har blågrønalgetoksiner haft markante lethale effekter på mennesker. I foråret 1996 døde 55 patienter efter at have været i dialyse på et dialysecenter i Caruarce, Brasilien. 44 af disse patienter døde af leverproblemer/leverblødning. Der kunne detekteres microcystiner i serum fra patienter i live samt i levervæv fra de afdøde patienter. Dialysecentret modtog vand fra et reservoir, hvor der var opblomstring af blågrønalger, og i centrets aktive kulfiltre til vandrensning måltes høje koncentrationer af micrycystiner (µgmg pr. gram filtermateriale) (Carmichael 1996).

Cancer
Nye forskningsresultater indikerer, at levertoksiner fra blågrønalger fremmer cancer (Nishiwaki-Matsushima et al. 1992, Falconer & Humpage 1996), og nogle toksiner er direkte carcinogene (Ohta et al. 1994). NishiwakiMatsushima et al. (1992) foreslår, at et markant højere antal tilfælde af levercancer hos befolkningsgrupper i Kina, som får drikkevand fra smådamme, i forhold til grupper som får drikkevand fra brønde (Yu 1989), kan skyldes tilstedeværelsen af microcystinproducerende Microcystis i dammene. En efterfølgende undersøgelse (Ueno et al. 1996) viste, at vandprøver fra damme eller floder oftere indeholdt levertoksiner end vand fra brønde. Desuden var toksinkoncentrationen højere i vand fra damme og floder. Også andre typer af blågrønalgetoksiner har cancerfremmende effekter. Den marine art Lyngbya majuscula producerer aplysiatoxin og lyngbyatoxin-A, som udover at give irritation af hud og slimhinder i mund og tarmsystem, kan fremme dannelsen af hudtumor.

Blågrønalgetoksiner har således ikke kun akutte effekter. Samlet giver de konstaterede sygdomstilfælde med forbindelse til blågrønalgeopblomstringer grund til stor forsigtighed, både når blågrønalgeholdigt vand anvendes til drikkevand og til rekreative formål.

1.2 Hvilke toksiner producerer blågrønalger?

For at undersøge om blågrønalgers toksiner er årsag til sygdomstilfældene, er det nødvendigt at vide, hvilke toksiner blågrønalger kan danne, hvordan de skal detekteres, og hvilke effekter de har. Siden 1972, hvor den kemiske struktur af det første blågrønalgetoksin blev bestemt, er der beskrevet over 50 toksiner, som er særegne for blågrønalger (Carmichael 1994). Dertil kommer en række toksiner, som også findes i andre organismegrupper.

Blågrønalger i ferskvand producerer 4 forskellige typer toksiner: levertoksiner, nervetoksiner, endotoksiner og cytotoksiner, og i det følgende gives en nærmere beskrivelse af de 4 typer.

1.2.1 Levertoksiner

Levertoksiner er de hyppigst rapporterede toksiner hos blågrønalger. I dag kendes 3 forskellige typer levertoksiner: microcystiner, nodulariner og cylindrospermopsin (tabel 1-4).


Effekter
Hos pattedyr er målorganet for levertoksiner (microcystiner og nodulariner) først og fremmest leveren. Toksinerne bliver sandsynligvis optaget af cellerne via de samme transportveje som galdesyre (Falconer 1993), og intracellulært medfører de på grund af deres specifikke hæmning af proteinfosfataserne 1 og 2A, at cytoskelettet ændres og cellerne deformeres (Eriksson et al. 1990). Deformering af levercellerne medfører blodtab, og ved kraftig forgiftning kan dette medføre dødsfald i løbet af få timer. Målorganet for disse toksiner er dog ikke leveren hos alle dyregrupper. Forsøg med vagtler har vist, at milten hos fugle, som fik injiceret microcystin-RR, forstørredes til ca. dobbelt størrelse, mens leveren ikke blev påvirket (Takahashi & Kaya 1993).

Udover eventuelle akutte forgiftninger forårsaget af levertoksiner, vækker den hyppige forekomst af disse toksiner i stigende grad bekymring, da det har vist sig, at de kan fremme tumordannelse. Øget vækst af levertumorer ved injektion af microcystin-LR er således vist hos rotter, hvor tumordannelsen var initieret ved injektion af diethylnitrosamin (Nishiwaki-Matsushima et al. 1992). Tilsvarende resultater er fundet for nodularin, hvor det desuden blev vist, at dette toksin er et carcinogen (Ohta et al. 1994). Tilsyneladende initierer microcystinerne ikke i sig selv levertumor (Carmichael 1994).

I langtidsforsøg (op til 1 år) med mus, hvis drikkevand bestod af forskellige sublethale koncentrationer af ekstrakt af toksisk Microcystis aeruginosa, øgedes dødeligheden samt antallet af leverskader i gruppen, som fik den højeste dosering (Falconer et al. 1988). Andre forsøg med mus viste, at såfremt tumordannelse initieredes med dimethylbenzanthracene, fremmede tilsætning af microcystinholdigt Microcystis ekstrakt til dyrenes drikkevand signifikant væksten af tumorerne (Falconer 1991). Årsagen til den cancerfremmende virkning af levertoksiner menes at være hæmningen af proteinfosfataserne, idet disse er vigtige i kontrollen af celledelinger.

Det mest almindeligt forekommende levertoksin, microcystin-LR, kan forårsage DNA-skader i leveren hos forsøgsdyr (mus) samt i cellekulturer in vitro (Lakshmana Rao & Bhattacharya 1996).

Microcystiner
Inden den kemiske struktur af de almindeligste levertoksiner, microcystinerne, blev beskrevet, blev de benævnt:

- "fast death factor" (Bishop et al. 1959)
- microcystin (Konst et al. 1965)
- cyanoginosin (afledt af cyanobacteria og Microcystis aeruginosa) (Boteset al. 1984)
- cyanoviridin (afledt af cyanobacteria og Microcystis viridis) (Kusumi etal. 1987)
- cyanogenosin (forkert stavning af cyanoginosin) (Painuly et al. 1988)
- Microcystistoxin (Runnegar & Falconer 1986).
- Oscillatoriatoxin (Eriksson et al. 1989)

Bishop et al. (1959) angav, at "fast death factor" hos Microcystis aeruginosa var et peptid, men først i 1984 lykkedes det Botes et al. (1984) at beskrive den kemiske struktur af cyanoginosin-LA (= microcystin-LA). Stoffet var, ligesom tre andre toksiner isoleret fra Microcystis aeruginosa (Botes et al. 1982), et cyklisk peptid bestående af syv aminosyrer. Det viste sig, at forskellen imellem de fire toksiner lå i to L-aminosyrer, de såkaldt variable aminosyrer. Betegnelsen-LA angiver, at dette toksin indeholder leucin og alanin som de to variable aminosyrer.

Struktur
I 1988 blev en generel nomenklatur for de levertoksiske heptapeptider fra blågrønalger foreslået (Carmichael et al. 1988a). Toksinerne er siden blevet betegnet microcystin efterfulgt af to bogstaver, som angiver de variable aminosyrer. I figur 1-3 er vist strukturformlen for en række microcystiner. En række forskellige kombinationer af de variable aminosyrer i microcystin er fundet i såvel naturlige opblomstringer som i kulturer af blågrønalger. Desuden kendes et stort antal microcystiner, hvor en eller flere af de øvrige fem aminosyrer er delvist modificeret. Der er således nu beskrevet over 50 derivater af microcystin (Sivonen 1996).

Toksicitet
Toksiciteten af de forskellige microcystin derivater varierer fra 50 til > 1200 µg pr. kg (udtrykt som LD-50 ved intraperitoneal injektion i mus, hvor LD50 er den dosis, der slår 50% af forsøgsdyrene ihjel) afhængig af variationerne i aminosyrerne. Variationer i aminosyrerne 2 og 4 (Fig. 1-3) giver kun mindre ændringer i toksiciteten, mens ændringer i glutaminsyreenheden samt nogle ændringer i Adda enheden medfører en meget kraftig reduktion af toksiciteten (Rinehart et al. 1994).

Figur 1-3

Struktur af microcystiner med angivelse af molekylevægten af nogle af de mest almindelige varianter (fra Carmichael & Falconer 1993).


Arter
Microcystiner er blevet påvist hos mange arter af blågrønalger (tabel 1-3 og bilag 1-3). De fleste rapporter omhandler Microcystis aeruginosa, og microcystiner er fundet hos denne art i de fleste områder af verden. Slægten Anabaena, som oftest forbindes med nervetoksiner (f.eks. anatoxin-a) har også vist sig at producere microcystiner. Tilsvarende findes mange rapporter fra Norden om microcystiner hos Planktothrix agardhii (= Oscillatoria agardhii).

Nodularier
Cylindrospermopsin
De øvrige levertoksiner, hvis kemiske struktur er kendt (nodulariner og cylindrospermopsin, er kun fundet hos hhv. brakvandsarten Nodularia spumigena og den subtropiske art Cylindrospermopsis raciborskii.

Nodularia spumigena forekommer tilbagevendende i Østersøen i sensommeren og danner ofte toksiske opblomstringer (Sivonen et al. 1989, Kononen et al. 1993). Disse opblomstringer har ved flere lejligheder forårsaget dødsfald af hunde, kalve og ænder (Nehring 1993).

Tabel 1-3

a) Nærmere oplysninger om fund og referencer i bilag 1-3.


Grænseværdier
Internationale grænseværdier for forekomst af levertoksiner i drikke og badevand eksisterer endnu ikke. I Australien er det foreslået, at der maksimalt må være 1 µg microcystin pr. liter i drikkevand (Falconer et al. 1994). Undersøgelser i Kina af forekomsten af levercancer i områder, hvor drikkevandet indeholder microcystiner, indikerer, at grænseværdien børe være lavere, og 13 ng pr. liter foreslås (Ueno et al. 1996).

1.2.2 Nervetoksiner

Nervetoksiner virker hurtigere end levertoksiner, og da de bl.a. rammer åndedrætsorganerne, kan selv små doser være lethale. Der er fundet en række forskellige nervetoksiner hos blågrønalger (tabel 1-4), hvoraf anatoxin-a er det mest udbredte (tabel 1-5, bilag 1-4).

Anatoxin-a er fundet hos en del arter af blågrønalger, mens de øvrige nervetoksiner endnu kun er påvist hos et fåtal af arter (tabel 1-5). Specielt slægten Anabaena indeholder mange arter, der kan producere nervetoksiner. Sammenlignes tabel 1-3 og 1-5 ses det, at en art kan producere flere forskellige typer af toksiner.

Virkemåder
Fælles for nervetoksinerne er, at de påvirker overførslen af impulser fra nerveceller til muskelceller og medfører kramper i musklerne. På cellulært niveau har det dog vist sig, at toksinerne har forskellige virkemåder.

Anatoxin-a virker postsynaptisk depolariserende ved den motoriske endeplade (Carmichael & Falconer 1993). Virkningen af toksinet svarer til virkningen af transmitterstoffet acetylcholin, men stimuleringen af musklen er vedvarende, idet acetylcholinesterase ikke kan nedbryde anatoxin-a.


Tabel 1-4
Lever og nervetoksiner med kendt kemisk struktur.
Lever og nervetoksiner med kendt kemisk struktur.

a) LD50 bestemt ved intraperitoneal injektion i mus.
b) LD50angivet som 2,1 mg/kg efter 24 timer og 0,2 mg/kg efter 5-6 dage.


Anatoxin-a(s) virker som anatoxin-a ved den motoriske endeplade, men den toksiske effekt skyldes her, at anatoxin-a(s) hæmmer acetylcholinesterase (Mahmood & Carmichael 1986). Betegnelsen anatoxin-a(s) skyldes, at dette toksin hos forsøgsdyr bevirker kraftig spytafsondring (salivation). Hos rotter giver det desuden blodlignende tårer (Carmichael & Falconer 1993).

PSP står for "paralytic shellfish poisoning". PSP-toksinerne blokerer natriumkanalerne i nerverne og forhindrer udbredelsen af nerveimpulser (Adelman et al. 1982). Der kendes i dag 18 forskellige PSP-toksiner, og de er alle bygget over det samme skelet (tetrahydropurin) med variationer i 4 radikaler (figur 1-4). Toksinerne tilhører 3 kemiske grupper: carbamatetoksiner, decarbamoyltoksiner og N-sulfocarbamoyltoksiner (Oshima et al. 1989), hvor de første er de mest og de sidste de mindst toksiske (Sullivan & Wekell 1986). De mest toksiske forbindelser er saxitoksin (STX) og gonyautoksin 3 (GTX3) (figur 1-4). Toksinerne kan omdannes til hinanden, som vist i figur 1-5.

PSP-toksinerne er de kraftigst virkende nervetoksiner og var indtil for få år siden kun fundet hos arten Aphanizomenon flosaquae i USA (Mahmood & Carmichael 1986), men inden for de seneste år er de ligeledes detekteret i Anabaena circinalis og Lyngbya wolleii (tabel 1-5, bilag 5). PSP-toksiner forbindes normalt med det marine miljø, hvor flere dinoflagellater er kendt for at producere PSP. Toksinerne opkoncentreres i muslinger og medfører forgiftningstilfælde og dødsfald hos mennesker, der spiser de marine muslinger. Australien oplevede i 1991 en stor opblomstring af Anabaena circinalis, (Humpage et al. 1994, Negri & Jones 1995), men så vidt vi ved, er der hverken her eller andre steder observeret forgiftningstilfælde eller dødsfald hos mennesker, som kan forbindes med PSP-producerende blågrønalger. I Danmark er der detekteret PSP-toksiner i flere søer (denne undersøgelse).

Figur 1-4
Kembisk opygning af PSP-toksiner. Kemisk struktur: modificeret efter Sullivan & Wekell (1986). C2 er identisk med GTX8. GTX5-6 kaldes også B1-2. STX = saxitoxin, GTX = gonyantoxin. Relativ toksicitet fra Humpage et al. (1994) og for C2 Shimizu (1987).

Anatoxin-a(s)
Anatoxin-a(s) hæmmer acetylcholinesterase. Der er kun få rapporter om forekomsten af dette toksin, og alle stammer fra Nordamerika. Under opblomstringer af Anabaena lemmermannii i Knud Sø ved Ry i somrene 1993 og 1994 blev der fundet døde fugle langs søbredderne. Ved obduktion fandtes mange Anabaena celler i maverne, og algemateriale indsamlet i søen på det pågældende tidspunkt var meget kraftigt nervetoksisk ved musetest. Hverken anatoxin-a eller PSP-toksiner kunne spores i algematerialet. Symptomerne ved musetesten, hvor musene fik injiceret høje doser algemateriale (> 0,8 mg pr. mus), viste heller ikke tegn på anatoxin-a(s). Ved lavere doser fik nogle af musene tårer i øjnene og spyt omkring munden (se kapitel 2), hvilket er karakteristisk for toksiner, der hæmmer cholinesterase (f.eks anatoxin-a(s)). En nærmere undersøgelse af toksinet i dette materiale bekræftede tilstedeværelsen af anatoxin-a(s) (Henriksen et al. 1997, Onodera et al. 1997).

Grænseværdier
Der er ikke fastlagt grænseværdier for nervetoksiner i bade og drikkevand. Den internationale grænseværdi for koncentrationen af PSP-toksiner i muslinger og lign., der sælges som konsum, er 80 µg STX pr. 100 g muslingekød (svarende til 444 museenheder, se senere).

Tabel 1-5

a) Nærmere oplysninger om fund og referencer i bilag 1-4 og 1-5.

1.2.3 Cyto- og endotoksiner

Cytotoksiner
Cytotoksiner ødelægger celler og kan slå encellede organismer som alger, bakterier og virus ihjel, men er ikke dødelige for flercellede organismer. Blågrønalger producerer en lang række af cytotoksiner (Carmichael 1994).

Endotoksiner
Endotoksinerne er lipopolysaccharider (forkortes LPS), og disse toksiner dannes af alle gramnegative bakterier. Som nævnt (i forordet) er blågrønalger en type bakterier og hører til den gruppe, der kaldes gramnegative. Lipopolysaccharider hos blågrønalger og deres eventuelle toksicitet er endnu kun lidt undersøgt, men de mistænkes for at kunne give hudirritationer hos mennesker, som bader i vand med algeopblomstringer (NRA 1990) samt at give mavetarm problemer og badfeber (Annadotter 1993, NRA 1990, Rylander et al. 1989). En undersøgelse af lipopolysaccharider fra Microcystis aeruginosa har vist, at de ved injektion i mus i doser på 1,0-1,2 mg pr. kg slog musene ihjel (Raziuddin et al. 1983). Det bør derfor undersøges, om lipopolysaccharider kan være årsagen til, at man i musetest ofte ser, at musene dør i løbet af ca. 1 døgn uden tegn på beskadigelse af de indre organer. Denne type respons i musetesten er blevet betegnet "protracted" (langtrukken) toksicitet (Skulberg et al. 1994), og blev i forbindelse med en undersøgelse af toksiske blågrønalgeopblomstringer i Norge fundet i 35 ud af i alt 64 prøver (Skulberg et al. 1994).

LPS-endotoksiner hos blågrønalger er beskrevet af f.eks. Weckesser et al. (1979), Keleti & Sykora (1982) og Raziuddin et al. (1983).

fortsættes på næste side