Blågrønalgetoksiner i bade- og drikkevand

fortsat fra forige side

1.3 Nedbrydning af blågrønalgetoksiner

1.3.1 Kemisk stabilitet

Microcystiner
Microcystiner er generelt meget stabile. De ødelægges først ved temperaturer over 200°C (Weckesser & Martin 1990), og kogning af microcystinholdigt algemateriale er blevet benyttet til opkoncentrering af toksinerne samt til sterilisering af prøver inden musetest (Falconer 1993). Tørring af algemateriale i ovn ved 70°C natten over (Jones et al. 1994) eller ved 95°C fra 1 time op til 2 døgn (Kiviranta et al. 1991b) er blevet brugt som alternativ til frysetørring.

Microcystin-LR er meget stabilt over for sollys. I forsøg med microcystin-LR opløst i destilleret vand eksponeret for naturligt sollys, kunne mere end 86% af toksinet genfindes efter 26 dage. Blev toksinopløsningen tilsat pigmenter ekstraheret fra blågrønalger, skete nedbrydningen af toksinet hurtigere. Ydermere bevirkede en tilsætning af pigmenter, at en større mængde af toksinet blev omdannet til den ikke-levertoksiske isomer 6(Z)Adda microcystin-LR (Tsuji et al. 1994).

Ved bestråling med UV-lys med bølgelængder omkring microcystiners absorptionsmaksimum (238-240 nm) nedbrydes toksinerne hurtigt. Nedbrydningen afhænger af lysintensiteten (Tsuji et al. 1995, Kaya & Sano 1998).

Anatoxin-a
Anatoxin-a er ustabilt over for sollys ved høj pH. Ved eksponering for naturligt sollys i august måned (i USA) ved pH 9 var halveringstiden for anatoxin-a 96 minutter (Stevens & Krieger 1991). I tilsvarende forsøg udført ved pH 2 blev anatoxin-a ikke nedbrudt. Halveringstiden for anatoxin-a ved pH 9 eksponeret for sollys i november-december var 330 minutter (Stevens & Krieger 1991).

Ved tørring af anatoxin-a holdigt algemateriale blev over 50% af toksinet nedbrudt i løbet af fire timer ved 95°C (Kiviranta et al. 1991b), men Falconer (1993) angiver, at anatoxin-a ikke nedbrydes under kogning ved neutral pH.

Anatoxin-a(s)
Anatoxin-a(s) nedbrydes hurtigt under basiske forhold, mens det ved neutral pH og pH 3-5 er relativt stabilt. Inddampning af en opløsning af det rene toksin i methanol medførte betydelig hydrolyse af toksinet, og under opbevaring ved -20°C blev toksinet langsomt nedbrudt (Matsunaga et al. 1989). Toksinet inaktiveres ved temperaturer over 40°C (Carmichael & Falconer 1993).

PSP-toksiner
PSP-toksinerne er stabile ved lav pH (2-4) og lave temperaturer (< 0^oC) Louzao et al. 1994a). Frysetørring har ingen indflydelse på saxitoxin, og saxitoxin kan holde sig i flere år i så vel sur opløsning som frysetørret (Alfonso et al. 1994). For de andre PSP-toksiner virker høje temperaturer og frysetørring nedsættende på stabiliteten. Især N-sulfamat-toksinerne (C-toksinerne) bliver ustabile og omdannes let til de mere toksiske carbamat-toksiner (Alfonso et al. 1994, Hall & Reichardt 1984, Louzao et al. 1994b). Normalt frysetørres toksinprøver og opbevares i fryser indtil analyse, men nyere undersøgelser (Alfonso et al. 1994, Louzao et al. 1994a og b) indikerer, at en mere optimal procedure vil være at ekstrahere toksinerne så hurtigt som muligt, og derefter opbevare toksinerne i sur opløsning i fryser indtil analyse.

I forsøg, hvor PSP-toksiner ekstraheret fra Anabaena circinalis blev sat til ferskvand, kunne toksinerne stadig detekteres i vandet efter 90 dage. Både ved tilsætning til sterilt og ikke-sterilt vand skete der i løbet af de 90 dage en omdannelse af toksinerne, så indholdet af C-toksiner faldt, mens koncentrationen af dc-GTX toksiner steg. Omdannelsen skete hurtigst i det ikke-sterile vand, og på grund af toksinernes forskellige toksicitet, øgedes den samlede toksicitet i vandet med en faktor 5-6 i løbet af de første 10-20 dage. Herefter faldt den samlede toksicitet, indtil forsøgets afslutning efter 90 dage (Jones & Negri 1997).

Figur 1-5

Omdannelsesveje
C1	-->	GTX2	-->	dc-GTX2
C2	-->	GTX3	-->	dc-GTX3
C3	-->	GTX1	-->	dc-GTX1
C4	-->	GTX4	-->	dc-GTX4
GTX5	-->	STX	-->	dc-STX
GTX6	-->	neo-STX	-->	dc-neo-STX

Omdannelsesveje efter Larsen et al. (1993).

1.3.2 Biologisk nedbrydning

Microcystiner
Biologisk nedbrydning af microcystiner er undersøgt i laboratorieforsøg med rene toksiner (Watanabe et al. 1992a, Jones et al. 1994, Tsuji et al. 1994) og med toksinproducerende kulturer af blågrønalger (Kiviranta et al. 1991a, Watanabe et al. 1992a) samt i naturen under induceret lysis af en opblomstring af Microcystis aeruginosa (Jones & Orr 1994).

Undersøgelserne viser både direkte (Jones et al. 1994) og indirekte (Berg et al. 1987a, Watanabe et al. 1992a, Jones & Orr 1994), at microcystin kan nedbrydes mikrobielt, men samtidig, at der ikke altid er mikroorganismer til stede i vandet, som kan foretage denne nedbrydning (Kiviranta et al. 1991a). Kiviranta et al. (1991a) tilsatte flodvand med de naturligt forekommende mikrooganismer til axeniske (bakteriefri) kulturer af Oscillatoria agardhii. Mikroorganismerne øgede ikke nedbrydningen af toksin i vandfasen, og efter 8 uger fandtes stadig høj koncentration af toksin i kulturerne.

I forbindelse med nedbrydningen af en ikke axenisk Microcystis aeruginosa kultur observeredes ændringer af bakteriesammensætningen (Watanabe et al. 1992a). Målinger af toksinkoncentrationen i kulturmediet viste, at microcystin-YR blev nedbrudt hurtigere end microcystin-LR. Efter 70 dage var begge toksiner stadig til stede i kulturen. Parallelt med dette blev nedbrydningen af rent microcystin-YR og LR i hhv. destilleret vand og kulturmedium undersøgt over 45 dage. I begge tilfælde blev microcystin-YR nedbrudt hurtigere end microcystin-LR. Efter 45 dage var microcystin-YR koncentrationerne reduceret til 69,2 og 58,6% (i hhv. destilleret vand og kulturmedium), mens microcystin-LR koncentrationerne var faldet til hhv. 85,4 og 86,2% af startkoncentrationerne.

I begge laboratorieforsøg med algekulturer (Kiviranta et al. 1991a, Watanabe et al. 1992a) fandtes toksinerne (hhv. desmethyl3microcystin-RR fra Oscillatoria agardhii og microcystin-LR og YR fra Microcystis aeruginosa) overvejende intracellulært indtil afslutningen af algernes eksponentielle vækstfase og begyndende lysis af cellerne, hvor toksinerne blev frigivet til vandet.

I et laboratorieforsøg med nedbrydning af indsamlet naturligt materiale af Microcystis aeruginosa angav Berg et al. (1987a), at 90% af toksinet (microcystin-LR iflg. Krishnamurthy et al. [1989]) blev nedbrudt mikrobielt i løbet af 40 dage.

Jones & Orr (1994) undersøgte in situ nedbrydning af microcystin-LR efter algicid behandling af et Microcystis aeruginosa bloom i Australien. Toksinindholdet i vandet blev målt vha. HPLC samt med proteinfosfatase inhiberingsassay. HPLC analyserne viste, at efter ni dages lagfase blev 90-95% af toksinet nedbrudt på tre dage. Herefter fulgte en fase med langsommere nedbrydning af det resterende toksin. Inden den hurtige nedbrydning af toksinet startede, sås en markant stigning i inhibering af proteinfosfatase, hvilket indikerede en begyndende mikrobiel omsætning, som resulterede i et nedbrydningsprodukt med kraftigere effekt på proteinfosfatase end microcystin-LR.

Laboratorieforsøg med nedbrydning af rent toksin (microcystin-LR) sat til naturlige vandprøver, viste forskellige nedbrydningshastigheder i de forskellige vandtyper, men et generelt mønster med en lagfase eller en periode med langsom nedbrydning, efterfulgt af en hurtig nedbrydning af toksinet (Jones et al. 1994). Blev der efter den hurtige nedbrydning tilsat yderligere toksin, fortsatte den hurtige nedbrydning uden lagfase. Nedbrydningshastigheden (udtrykt som mg pr. liter pr. dag) var proportional med startkoncentrationen af toksin i forsøgene med tilsætning til flodvand. Nedbrydningen blev vist at foregå overvejende intracellulært, og en isoleret bakteriestamme (en Sphingomonas sp., Bourne et al. 1996) kunne nedbryde både microcystin-LR og RR, men ikke pentapeptidet nodularin. Nedbrydningen af microcystin-LR foregik ved hjælp af mindst 3 intracellulære hydrolytiske enzymer (Bourne et al. 1996).

Resultaterne af de ovenstående undersøgelser er samlet i tabel 1-6 og 1-7.

Anatoxin-a
Biologisk nedbrydning af anatoxin-a er undersøgt i studier med ikke-axceniske (ikke bakteriefri) kulturer af Anabaena circinalis (Kiviranta et al. 1991a). Anatoxin-a blev hovedsageligt fundet intracellulært under den eksponentielle vækstfase. Toksinet lækkede fra cellerne til kulturmediet, når cellerne lyserede. Den maksimale intracellulære anatoxin-a koncentration (ca. 750 µg pr. 100 ml kultur) var ca. 100 gange højere, end den højeste toksinkoncentration fundet i kulturmediet. Af 11 typer bakterier isoleret fra Anabaena kulturen kunne en Pseudomonas sp. (muligvis Pseudomonas fluorescence) nedbryde anatoxin-a. Nedbrydningshastigheden var i det pågældende forsøg 6-30 µg pr. ml pr. 3 dage (Kiviranta et al. 1991a).

Tabel 1-6

Nedbrydningsrater for microcystin-LR i laboratorieforsøg med kulturer, rent toksin og indsamlet naturligt materiale samt in situ studier af en naturlig opblomstring.

Tabel 1-6

a) Toksiciteten opgivet som "Mouse Units", hvor en mouse unit svarer til den mindste dosis algemateriale, som slår en 20 g mus ihjel indenfor fire timer ved musetest.
b) Vandtyper testet: Destilleret vand, filtreret flodvand, flodvand + næring og ufiltreret flodvand.

Tabel 1-7

Nedbrydningsrater for microcystin-YR, RR og desmethyl-3-microcystin-RR i laboratorieforsøg med kulturer samt rene toksiner.

Tabel 1-7

a) Toksinkoncentrationen givet som summen af toksin i algecellerne og i vandet.


PSP
Biologisk transformation af PSP-toksiner er undersøgt hos flere muslingearter, og generelt er toksinprofilen og toksiciteten i dyrene forskellig fra den, der findes hos de alger, der er årsag til akkumuleringen af toksiner. Jury et al. (1994) viste, at C-toksiner (C1-C4) og neo-saxitoxin i gonaderne på kammuslinger omdannes til gonyautoxinerne GTX2, GTX3 og til saxitoxin (STX) med deraf følgende øget toksicitet af muslingerne. Enzymatisk omdannelse af PSP-toksiner i muslinger er vist af Shimizu & Yoshioka (1981) og Sullivan et al. (1983). Kotaki et al. (1985) isolerede Psedomonas sp. og Vibrio sp. fra marine krabber og snegle og viste, at disse bakterier omdanner GTX2 og GTX3 til saxitoxin. Saxitoxinet blev derimod ikke påvirket af bakterierne.

1.3.3 Fjernelse af blågrønalger og toksiner ved vandrensning

Sandfiltrering og sandfiltrering kombineret med aktiv kulfiltrering
Undersøgelse af et vandrensningsanlæg i drift i Finland (Lepistö et al. 1994) viste, at hurtig sandfiltrering kun fjernede 14% af blågrønalgebiomassen, mens sandfiltrering efterfulgt af aktiv kulfiltrering fjernede 42%.

Reduktion af toksinkoncentration ved langsom filtrering gennem sandfiltre blev undersøgt i laboratorieforsøg af Keijola et al. (1988). To filtre med diameter 14 cm og sandhøjde 24 cm blev igangsat med sand fra et stort sandfilter i drift. Vand med hhv. anatoxin-a ekstraheret fra frysetørret Anabaena flosaquae og levertoksiner fra Microcystis aeruginosa (ét toksin) og Oscillatoria agardhii (= Planktothrix agardhii) (to toksiner) blev filtreret igennem sandet med en hastighed på 0,085 m pr. time, svarende til 1,42 l pr. m² pr. min. Anatoxin-a koncentrationen reduceredes hhv. 68 og 74% ved filtrering igennem filtrene og levertoksinet fra M. aeruginosa 86 og 82%. Et af levertoksinerne fra O. agardhii blev ikke fjernet ved filtreringen, mens det andet reduceredes med hhv. 29 og 65%.

Forsøg med filtrering gennem et 0,3 m², 0,7 m højt sandfilter med en vandgennemstrømning på 80-90 l pr. m² pr. min viste, at denne filtrering alene hverken kunne fjerne levertoksin fra Microcystis aeruginosa eller nervetoksin fra Anabaena circinalis (Falconer et al. 1983b, Falconer et al. 1989). Placeredes et 7-8 cm højt lag granuleret aktivt kul ovenpå sandet fjernedes toksinerne fuldkommen. Forskellige fabrikater af kul blev testet, og de kunne alle fjerne toksinerne, mens varigheden af evnen til adsorption af toksiner varierede imellem de forskellige kultyper. For levertoksinerne kunne filtret reducere toksinkoncentrationen til under detektionsgrænsen (svarende til < 5% af den oprindelige toksicitet) i 8-20 m³ toksinholdigt vand afhængig af typen af kul. To forskellige typer kul blev benyttet i forsøgene med nervetoksiner, og de kunne tilsvarende reducere toksinerne i hhv. 12 og 16 m³ vand (Falconer et al. 1989).

Adsorptionen af microcystin-LR har ligeledes vist sig at variere imellem en række aktive kulpulvere (Donati et al. 1994).

Fjernelse af alger og toksiner ved forskellige vandrensningsprocesser
I Norge er der lavet en undersøgelse af et vandrensningsanlæg i drift ved Akersvatn, som i mange år har haft store opblomstringer af levertoksisk Microcystis aeruginosa (Ohren 1988). Vandbehandlingen var filtrering gennem sand og antrasit med aluminium sulfat og Magnafloc LT-20 som koagulanter. Behandlingen fjernede 98% af såvel M. aeruginosa som toksinet fra algerne. På trods af den høje rensningseffekt var opkoncentreret vand, som havde passeret vandrensningsprocessen, levertoksisk ved musetest. Ohren (1988) betegner den mængde alger og toksiner, der akkumuleres i filtret under driften, som en "giftbombe". Uheld eller ændrede driftsforhold kunne eventuelt frigive noget af toksinet til det rensede vand, som når frem til forbrugerne.

Fjernelse af alger i anlæg i drift
I en undersøgelse af fire finske vandrensningsanlæg i drift i 1991 (Lepistö et al. 1994) kunne to af anlæggene fjerne over 95% af blågrønalgebiomassen fra det indtagne vand. Det ene anlæg (Rymättylä) benyttede kontakt filtrering med aluminiumsulfat efterfulgt af aktiv kulfiltrering og klorbehandling. Her fjernedes gennemsnitligt 98% af blågrønalgerne. I det mest effektive anlæg (Raisio-Naantali) blev vandet tilsat aktivt kulpulver, efterfulgt af flokkulering med aluminiumsulfat og sedimentation inden sandfiltrering og klorbehandling. I dette anlæg reduceredes blågrønalgebiomassen gennemsnitligt 99,9%, men alligevel passerede tråde af Oscillatoria agardhii (= Planktothrix agardhii) vandrensningsprocessen under en opblomstring. Denne finske undersøgelse er utilstrækkelig med hensyn til, hvorledes de forskellige anlæg fjerner toksiner fra vandet, idet der i perioden kun forekom en enkelt toksisk opblomstring. Dette var en opblomstring af Anabaena lemmermannii indeholdende et ukendt nervetoksin registreret ved musetest af frysetørret algemateriale indsamlet i søen. Opkoncentrerede prøver af det behandlede vand var ikke toksiske i musetest.

Fjernelse af toksiner i laboratorieforsøg
Fjernelse af hhv. levertoksiner (microcystiner) fra Microcystis aeruginosa og Oscillatoria agardhii og nervetoksinet anatoxin-a ved almindelige vandrensningsprocesser er blevet undersøgt i laboratorieskala (Keijola et al. 1988). Forsøgene blev udført med toksiner ekstraheret fra frysetørret algemateriale, dvs. frie toksiner i vandfasen. Toksinfjernelsen blev undersøgt ved følgende processer:

1) Flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + klorering

2) Flokkulering med jernklorid + sandfiltrering + klorering

3) Tilsætning af aktivt kulpulver (5 mg pr. liter) + flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + klorering

4) Flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + filtrering gennem granuleret aktivt kul + klorering

5) Ozonbehandling (1 mg O₃ pr. liter) + flokkulering med aluminiumsulfat + sandfiltrering + klorering

Kloreringen foregik i alle processerne ved tilsætning af NaOCl svarende til en koncentration på 0,5 mg Cl₂ pr. liter.

Processerne 1-3 reducerede koncentrationen af levertoksiner 0-34% afhængig af metode og toksin. Koncentrationen af nervetoksinet anatoxin-a reduceredes 0-82% afhængig af metode samt startkoncentration af toksinet.

Effektiv fjernelse af toksiner blev fundet i processerne 4 og 5, hvor levertoksinerne fjernedes 100% og anatoxin-a koncentrationen reduceredes 94-100%.

I pilotforsøg i lidt større skala bekræftedes de generelle tendenser fundet i laboratorieforsøgene (Keijola et al. 1988). Disse forsøg blev foretaget med levertoksiner ekstraheret fra frysetørret algemateriale samt med friskt materiale fra en Microcystis aeruginosa opblomstring. Forsøgene bestod af en almindelig vandrensningsproces (flokkulering med aluminiumsulfat, sedimentation og filtrering) samt den almindelige proces indledt med enten ozonbehandling eller tilsætning af aktivt kulpulver.

Fjernelsen af toksiner var mest effektiv i forsøg med frisk blågrønalgemateriale. Alene den første ozonbehandling (1,0-1,5 mg pr. liter) reducerede her toksinkoncentrationen over 90%. Tilsvarende fjernede tilsætning af 20 mg aktivt kul pr. liter inden den normale proces over 99% af toksinet.

I forsøgene med ekstrakter fra frysetørrede alger reducerede den indledende ozonbehandling toksinkoncentrationen ca. 50%, og ca. 10% kunne genfindes efter hele rensningsprocessen. Indledende tilsætning af 20 mg aktivt kulpulver pr. liter fjernede 90% af toksinet, mens 100 eller 200 mg pr. liter fjernede toksinet totalt.

Effekten af klorbehandling på nedbrydning af microcystin-LR og LA ekstraheret fra Microcystis aeruginosa og nodularin ekstraheret fra Nodularia spumigena er blevet undersøgt i laboratorieforsøg (Nicholson et al. 1994).

Tilsætning af mere end 1 mg Cl₂ pr. liter eller 2,5 mg Ca(OCl)₂ pr. liter fjernede indenfor 30 min over 95% af microcystinerne og nodularin (startkoncentrationer 130-300 µg pr. liter). Derimod blev kun 70-80% af microcystinerne fjernet ved tilsætning af NaOCl (koncentration > 5 mg pr. liter).

Nedbrydningen af toksinerne var pH-afhængig. Ved pH < 8 fjernedes microcystinerne helt ved tilsætning af Cl₂ eller Ca(OCl)₂ i koncentrationer på 15 mg pr. liter i 30 min. Effekten af NaOCl var lidt mindre (ca. 95% reduktion i toksinkoncentrationen). Nedbrydningen af microcystinerne reduceredes markant ved pH > 8 ved brug af NaOCl og Ca(OCl)₂ og ved pH > 9, når Cl₂ blev benyttet.

Forsøg med nedbrydning af microcystin-LR og LA ved tilsætning af 20 mg monokloramin viste kun en meget lille reduktion (17%) i toksinkoncentrationen efter 5 dage (Nicholson et al. 1994).

Ved omvendt osmose kunne 96,7-99,9% af microcystin-LR og RR fjernes fra ferskvand og 3‰ saltvand (Neumann & Weckesser 1998) og nodularin fjernes fra brakvand (Vuori et al. 1997).

Fjernelse af alger og toksiner i anlæg i drift
En omfattende undersøgelse af forekomst af blågrønalger og toksiner fra disse ved to vandrensningsanlæg blev foretaget i Sverige i 1989 og 1991 (Annadotter 1993).

I anlægget ved Finjasjön filtreres søvandet først gennem en 55 µm si og siden gennem et 1,16 m højt sandfilter, inden det ledes ud i en infiltrationsdam. Herfra siver vandet ned igennem 30 m grus, inden det pumpes op og sendes ud til konsumenterne.

Vombsjöns anlæg filtrerer vandet gennem en 45 µm si og leder det så ud i en række infiltrationsbassiner. Herfra infiltreres vandet gennem et 25 m dybt lag grus og sand og klorbehandles, inden det sendes ud til konsumenterne.

Toksiciteten af algerne i søerne samt forskellige steder i vandrensningsprocesserne blev bestemt ved musetest samt ved HPLC-analyser for microcystiner. Desuden blev vandprøver udtaget forskellige steder i vandrensningsprocesserne og analyseret for opløste microcystiner i vandet ved hjælp af HPLC.

I Finjasjöns anlæg reduceredes mængden af alger (målt som klorofyl a koncentrationen) i september 1989 i gennemsnit 63% ved filtreringen gennem sien og sandfiltret. I tre ud af fire målinger fandtes der større mængder af alger i infiltrationsdammene end umiddelbart efter sandfiltret. I det ene tilfælde var algemængden endda større end ved vandindtaget i søen. Både ved vandindtaget lige inden sandfiltret og i infiltrationsdammen blev der i september 1989 fundet toksiske alger. Derimod blev der ikke registreret opløste microcystiner i vandet (detektiongrænse 0,5 µg pr. liter).

I Vombsjön i 1991 reduceredes algemængden (målt som klorofyl a koncentrationen) i gennemsnit 25% ved filtreringen igennem 45 µm sien. I denne sø var 15 ud af 18 algeprøver indsamlet i 1991 toksiske (musetest), og i en enkelt ud af i alt 36 vandprøver indsamlet i anlægget blev der påvist frit levertoksin. Denne prøve var taget efter 45 µm sien og indeholdt 827 ± 65 ng microcystin-LR pr. liter. Der kunne ikke spores toksiner i det færdigt behandlede vand.

Sammenfatning
Indvindes søvand til anvendelse som drikkevand skal der tages forholdsregler for at fjerne såvel blågrønalgeceller som eventuelle frie toksiner i vandet.

Placeres vandindtaget på forholdsvis dybt vand, kan de generelt højere koncentrationer af alger i overfladevandet undgås, men denne placering kan dog også være problematisk. Östra Kyrksundet på Ålandsøerne bliver benyttet til vandforsyning. I 1987 forekom store mængder af levertoksinproducerende Oscillatoria agardhii (= Planktothrix agardhii) i søen, og i august måned blev de højeste alge og toksinkoncentrationer fundet i 6 meters dybde, hvor vandindtaget er placeret (Lindholm et al. 1989).

Frafiltrering af algerne i forbindelse med vandindtaget er vigtigt for at fjerne eventuelle toksiner, idet blågrønalgetoksinerne overvejende findes intracellulært, så længe algerne er i vækst og først frigives til vandet i større mængde, når algepopulationen henfalder (NRA 1990, Kiviranta et al. 1991a, Watanabe et al. 1992b). Filtreringen skal så vidt muligt være skånsom for at forhindre ødelæggelse af algecellerne med efterfølgende frigivelse af toksiner til vandet.

Tilbageholdelse af algeceller og toksiner ved sandfiltrering er generelt ringe, om end varierende. Tilsætning af aktivt kulpulver, flokkulering og sedimentation inden sandfiltreringen giver en stor reduktion af algebiomassen og toksinindholdet.

Kombineres sandfiltreringen med aktivt kulfiltrering, kan toksinerne fjernes helt. Der er stor forskel på adsorptionskapaciteten for forskellige typer aktivt kul.

Langsom sandfiltrering kan give en vis reduktion af frie toksiner i vandet, men processen er afhængig af biofilmen i filtret (Keijola et al. 1988).

Indledende ozonbehandling af vandet kan fjerne toksinerne helt. Det er muligt, at ozonbehandling senere i processen vil være mere effektiv, idet en større del af den oxidative kapacitet vil kunne bruges på toksiner i stedet for reaktioner med andet organisk materiale (Keijola et al. 1988).

Fjernelse af microcystiner ved klorering vil afhænge af en kombination af den anvendte klorforbindelse, koncentrationen og pH. Laboratorieforsøg har vist en effektiv fjernelse ved tilsætning af Cl₂ eller Ca(OCl)₂ (15 mg pr. liter) ved pH lavere end 8 (Nicholson et al. 1994).

1.4 Detektion af blågrønalgetoksiner

Den første metode, der blev brugt til at eftervise toksinproduktionen hos blågrønalger, var injektion af algemateriale i bughulen på mus. Denne musetest anvendes stadig hyppigt, men er i takt med det stigende kendskab til toksinernes kemi blevet afløst af eller suppleret med en række kemiske analyser og biologiske assays. I det følgende beskrives en række metoder til detektion af toksinerne.

1.4.1 Bioassays

Musetest
Ved en musetest injiceres algemateriale i bughulen på forsøgsmus, som efterfølgende observeres for respons (Falconer 1993). Typisk anvendes hvide mus med en vægt på ca. 20 g. Generelt bruges frysetørret algemateriale, som inden injektionen opslemmes i 0,1- 1,0 ml 0,9% NaCl. Brugen af frysetørret materiale vil give bedre ekstraktion af de intracellulære toksiner, idet en stor del af cellerne under frysningen vil blive ødelagt. Desuden giver brugen af frysetørret materiale mulighed for at relatere respons direkte til algetørvægten. Ved injektion af varierende mængder af algemateriale i en række mus kan LD50 beregnes.

Musetesten er uspecifik, idet musens respons på injektionen af algerne ikke afslører nøjagtig, hvilket toksin prøven måtte indeholde (undtaget anatoxin-a(s)). Til gengæld er det en styrke ved denne test, at den i modsætning til specifikke kemiske analyser også vil registrere tilstedeværelsen af ukendte toksiner. På baggrund af det tidsrum der går fra injektionen til musens død, musens opførsel samt leverens udseende ved efterfølgende obduktion, kan der dog med denne test skelnes mellem nervetoksiner og levertoksiner (tabel 1-8). En tredje type toksicitet, som kan registreres med musetesten, er blevet betegnet "protracted" (langtrukken) toksicitet. Her dør musene i løbet af 4-24 timer uden tegn på organskader (Skulberg et al. 1994). Det vides ikke, hvilke stoffer toksiciteten kan tilskrives.
Musetesten er benyttet til at vurdere toksiciteten af forskellige rene toksiner isoleret fra blågrønalger og er bl.a. blevet anvendt til at bestemme, hvilke kemiske strukturændringer i microcystinerne, der har betydning for toksiciteten (Stotts et al. 1993).

Tabel 1-8
Symptomer samt overlevelse hos mus injiceret med lever eller nervetoksinholdigt blågrønalgemateriale.

Toksin	Overlevelse	Dødsårsag	Tegn på giftvirkning	Organforandringer ved obduktion
Levertoksiner	1-3 timer	forblødning	-bleghed (tydeligt på ørerne) -ligger på maven -lammelse af bagben -ryster	-forstørret, mørk, blodfyldt lever -levervægt øget til 8-10% af kropsvægten (mod normalt ca. 5%)
Nervetoksiner	2-30 minutter	lammelse af åndedrættet	-problemer med vejrtrækning -rystelser -kramper	-ingen

Sivonen et al. (1990a).

Musetesten kan i nogle tilfælde overvurdere toksiciteten. F.eks. ekstraheres PSP-toksiner ud af algematerialet inden injektion i musene ved brug af saltsyre, og i det sure miljø kan de lavtoksiske PSP-toksiner (N-sulfocarbamattoksiner) omdannes til de mere toksiske carbamattoksiner (Larsen et al. 1993). Desuden kan forekomst af nogle salte og metaller påvirke udfaldet af testen.

Musetest er den internationalt anerkendte metode til testning af PSP-toksicitet (metode ifølge Association of Official Analytical Chemists, AOAC, 1984) i fødevarer som f.eks. blåmuslinger. Toksiciteten måles i museenheder, hvor 1 museenhed (MU) = den mængde, der skal til at slå en 20 grams mus ihjel indenfor 15 minutter. Grænseværdien for PSP-toksiner er 80 µg STX pr. 100 g muslingekød svarende til 444 museenheder (MU) pr. 100 g muslingekød. Den aktuelle omregningsfaktor afhænger af den anvendte musestamme. Er PSP-koncentrationen målt med HPLC (se under HPLC), omregnes toksiciteten af de enkelte toksiner til STX-ækvivalenter (se figur 1-4). Detektionsgrænsen for musetesten er ca. 40 µg STX pr. 100 g (Sullivan & Wekell 1986). Tilsvarende grænseværdier findes ikke for de andre blågrønalgetoksiner.

Microtox assay
Anvendelsen af Microtox assay (Microtox Toxicity Analyzer Model 500, Microbics Corporation, Carlsbad, CA (Microbics 1982)) til hurtig screening for toksicitet i prøver af blågrønalger blev foreslået af Lawton et al. (1990). I dette bioassay vurderes toksiciteten af prøven udfra en bestemmelse af den koncentration, som giver 50% hæmning af bioluminescencen hos bakterien Photobacterium phosphoreum (EC₅₀). Metoden blev anvendt af Volterra et al. (1992), som dog angav afvigelser af toksicitetsbestemmelsen i forhold til HPLC analyser. Ved en sammenlignende undersøgelse af Microtox assayet med bl.a. HPLC analyser af toksinindhold i en række ekstraherede fraktioner af blågrønalgeprøver viste det sig, at der ikke var korrelation mellem forekomsten af microcystin-LR og toksicitet registreret med Microtox assayet (Campbell et al. 1994), og dette assay anses derfor som uegnet til påvisning af microcystin, men kan eventuelt benyttes til påvisning af andre bioaktive stoffer hos blågrønalger.

Artemia salina bioassay
Et biologisk assay, som benytter saltsørejen Artemia salina er beskrevet af Kiviranta et al. (1991b). I dette assay sættes forskellige koncentrationer af vandige ekstrakter fra frysetørrede blågrønalgeprøver til nyklækkede Artemia larver, og efter 24 timers inkubation relateres dødeligheden af larverne til algekoncentrationen. Der er fundet god overensstemmelse mellem prøver, som er fundet toksiske med dette assay og prøver, hvor microcystiner (Kiviranta et al. 1991b, Campbell et al. 1994, Damsø et al. 1994, Lawton et al. 1994a) eller anatoxin-a (Kiviranta et al. 1991b) er påvist med HPLC. Artemia bioassayet er meget simpelt og billigt at udføre, men kræver større mængder af algemateriale end f.eks. HPLC. Desuden er det uspecifikt, idet det ikke kan skelne mellem forskellige toksintyper.

Celle assay
Flere typer af celle assay er anvendt til detektion af algetoksiner. Aune & Berg (1986) beskrev et in vitro assay, hvor friskt isolerede rotteleverceller inkuberes med vandigt ekstrakt af frysetørrede blågrønalgeprøver for at screene for tilstedeværelsen af levertoksiner. Et in vitro assay, hvor lækage af intracellulære enzymer fra museleverceller benyttes til detektion af levertoksiner (mikrocystiner) er beskrevet af Bhattacharya et al. (1996).
Jellett et al. (1995) har udviklet en procedure, hvor neuroblaster bruges til detektion af PSP-toksiner.

1.4.2 ELISA og enzyminhiberingsassays

En række analysemetoder anvender mere eller mindre toksinspecifikke antibodies eller detekterer hæmning af bestemte enzymer.

Antibodies og ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
Både mono og polyklonale antibodies mod microcystiner er blevet fremstillet i hhv. mus og kaniner (Kfir et al. 1986, Saito et al. 1994, Brooks & Codd 1988). Kfir et al. (1986) fremstillede monoklonale antibodies mod cyanoginosin-LA (= microcystin-LA), som viste sig at binde sig ligeså effektivt til seks andre varianter af microcystiner. Tilsvarende viste Saito et al. (1994) ved hjælp af ELISA, at monoklonale antibodies mod microcystin-LR reagerede med tre andre microcystiner samt med celleekstrakter af både toksiske og ikke toksiske Microcystis aeruginosa stammer. Undersøgelser af Brooks & Codd (1988) viste derimod, at polyklonale antibodies mod toksiner fra Microcystis aeruginosa ikke krydsreagerede med microcystiner fra Oscillatoria eller Anabaena.

Chu et al. (1989) fremstillede antibodies mod microcystin-LR, og detekterede disse med forskellige assays. Disse antibodies krydsreagerede med andre microcystiner og nodularin i forskellig grad (An & Carmichael 1994). Et ELISA til påvisning af microcystiner i alger og vand blev beskrevet af Chu et al. (1990). For microcystinLR var den nedre detektionsgrænse 0,2 µg pr. liter. Tilsvarende er der udviklet ELISA og EIA (enzyme immune assay) til påvisning af PSP-toksiner (Chu & Fan 1985, Usleber et al. 1991, Usleber et al. 1994).

ELISA er en hurtig og følsom metode til påvisning af microcystiner, men en række microcystinvarianter vil ikke blive detekteret på grund af manglende binding mellem de anvendte antibodies og toksinet (An & Carmichael 1994). Tilsvarende vil en række microcystiner reagere mindre end microcystin-LR med de anvendte antibodies, hvorved kvantificering af microcystinindholdet i algemateriale vil kunne være væsentligt forskellig ved anvendelsen af henholdsvis ELISA og HPLC (Henriksen & Moestrup 1997).

Proteinfosfatase inhiberingsassay
Toksiciteten af microcystiner kan tilskrives deres specifikke hæmning af de celleregulerende enzymer proteinfosfatase 1 og 2A (PP1 og PP2A) (Eriksson et al. 1990, MacKintosh et al. 1990). Denne egenskab udnyttes i proteinfosfatase inhiberingsassay, hvor in vitro hæmning af proteinfosfatase aktivitet benyttes til kvantificering af microcystiner (Boland et al. 1993, Holmes et al. 1994, Jones & Orr 1994, Lambert et al. 1994) samt okadainsyre (Holmes 1991, Boland et al. 1993), som tilsvarende hæmmer PP1 og PP2A. Okadainsyre er et diarréfremkaldende skaldyrstoksin, som er fundet hos nogle marine dinoflagellater.

Proteinfosfatase inhiberingen bestemmes ved at inkubere et 32P-mærket substrat (fosfoprotein), PP1/PP2A samt algeekstrakt i et givet tidsrum og bestemme frigivelsen af 32P ved scintillationstælling. Hæmningen af proteinfosfataserne bestemmes ved sammenligning med en kendt standard samt en kontrol (MacKintosh & MacKintosh 1994).

Holmes et al. (1994) angiver, at dette assay i kombination med en opkoncentrering af toksinerne vil kunne registrere microcystinkoncentrationer ned til 0,02 µg pr. liter.

An & Carmichael (1994) og Ward et al. (1997) beskrev proteinfosfatase inhiberingsassays baseret på en farveaktion, hvor proteinfosfataseaktiviteten blev bestemt udfra frigivelsen af pnitrophenol fra pnitrophenolfosfat. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at der ikke anvendes radioaktive isotoper.

Et af problemerne med dette assay er, at eventuel fosfataseaktivitet i algematerialet vil kunne skjule en hæmmende effekt forårsaget af microcystiner (Sim & Mudge 1993).

Acetylcholinesterase inhiberingsassay
Nervetoksinet anatoxin-a(s) virker ved at hæmme acetylcholinesterase. Ved at inkubere acetylcholinesterase med acetylthiocholin og dithiobisnitrobenzoat dannes et gult produkt, som kan registreres spektrofotometrisk. Tilsættes algeekstrakt med anatoksin-a(s) hæmmes reaktionen og dermed udviklingen af den gule farve (Ellman et al. 1961, Henriksen et al. 1997).

1.4.3 Kromatografi

Tyndtlagskromatografi
Tyndtlagskromatografi er blevet benyttet til at separere og identificere toksiske peptider (levertoksiner) fra blågrønalgeopblomstringer og kulturer (Codd et al. 1989, Poon et al. 1987, Ojanperä et al. 1995, Pelander et al. 1996). Denne metode har også vist sig anvendelig til isolering og oprensning af både peptid og alkaloid toksiner (hhv. lever- og nerve-toksiner) fra en kultur af Anabaena flosaquae, som producerede begge typer toksiner (Al-Layl et al. 1988).

Højtryksvæskekromatografi (HPLC)
HPLC er blevet benyttet til analyser af toksiner hos blågrønalger i en række undersøgelser. Analyserne er lavet på enten de intracellulære toksiner i tørret algemateriale eller toksiner i vand/kulturmedium. Analyseres tørret algemateriale, skal toksinerne først ekstraheres fra dette. Undersøges toksinindhold i vand vil toksinerne generelt skulle opkoncentreres inden analyserne.

Microcystiner
I tabel 1-9 er angivet en række eksempler på hvilke ekstraktionsmidler, opkoncentreringsmetoder samt HPLC-betingelser, der er blevet benyttet til analyser af microcystiner. Ved HPLC analyser af microcystiner i naturligt algemateriale eller søvand vil der være mulighed for at andre naturligt forekommende ikke toksiske stoffer elueres med samme retentionstid som standarderne. Derfor er det ikke tilstrækkeligt kun at basere analyserne på retentionstider og detektion ved en enkelt bølgelængde. Microcystiner har karakteristiske absorbtionsspektre med maksima ved 238 nm (eller 222 nm for enkelte tryptofan holdige derivater) (Lawton et al. 1994b), og analyserne bør derfor foretages med en Photo Diode Array (PDA) detektor, hvor absorbtionsspektrene i hele intervallet 200-300 nm registreres ved hver dataopsamling. Denne type detektion giver desuden mulighed for at analysere for microcystiner uden et stort udvalg af standarder (Lawton et al. 1994b). Af de over 50 beskrevne derivater findes der i dag kommercielt tilgængelige standarder af 4 microcystiner og 1 af nodularin.

Anatoxin-a
Detektion af anatoxin-a fra naturlige opblomstringer af blågrønalger (Edwards et al. 1992), blågrønalgekulturer (Harada et al. 1989, Rapala et al. 1993) og maveindholdet fra forgiftede hunde (Edwards et al. 1992) er udført ved hjælp af HPLC. Ekstraktion samt opkoncentrering af toksinet og HPLC betingelserne er angivet i tabel 1-10.

Som for microcystiner vil der også ved HPLC analyser for anatoxin-a være mulighed for eluering af ikke toksiske stoffer med samme retentiontid som standarden. Detektion med PDA detektor giver mulighed for sammenligning af standardens absorbtionsspektrum med spektre i mulige anatoxin-a toppe i de analyserede prøver (Edwards et al. 1992, Rapala et al. 1993), idet anatoxin-a har et karakteristisk absorbtionsmaksimum ved 227 nm (Devlin et al. 1977). Anatoxin-a standard er kommercielt tilgængelig.

Ved anvendelse af fluorescensdetektion er det muligt at sænke detektionsgrænsen for anatoxin-a til 10 ng pr. liter (James et al. 1998). Denne metode kan endvidere adskille anatoxina, homo-anatoxin-a samt flere nedbrydningsprodukter.

Tabel 1-9
HPLC-betingelser for microcystinanalyser angivet i fem forskellige undersøgelser.

Tabel 1-9

a) Metoden anvender en Photo Diode Array (PDA) detektor, hvor hele absorbtionsspektret fra 200 til 300 nm bruges til at bestemme microcystiner på baggrund af deres karakteristiske spektre.


Tabel 1-10
HPLC-betingelser for anatoxin-a analyser angivet i tre forskellige undersøgelser.

Ekstraktionsmiddel	0,05 M eddikesyre	Destilleret vand	Vand:methanol (50:50)
Toksin opkoncentrering	ODS-kolonne efterfulgt af	C-18 kolonne a)	C-18 kolonne
	COOH-kolonne
HPLC kolonne	Cosmosil 5C18	mBondapak C18	Regis Pinkerton GFF-S5-80
	(150 x 4,6 mm)	(300 x 3,9 mm)	(150 x 4,6 mm)
Solventer	Methanol:vand (6:4) eller	0,02 M kaliumdihydrogenfosfat (pH 2,5) : acetonitril	0,08 M fosfat buffer (pH 6,8) : acetonitril
	Methanol:0,01M NH4Cl (1:9)
Detektion	227 nm	200-300 nm b)	230 nm c)
Reference	Harada et al. 1989	Edwards et al. 1992	Rapala et al. 1993

a) Kun i analyser af maveindholdet fra døde hunde blev toksinet opkoncentreret.
b) Metoden benytter en Photo Diode Array (PDA) detektor, hvor absorbtionsspektret i bølgelængdeintervallet 200-300 nm registreres og benyttes til genkendelse af toksinet.
c) Metoden benytter en PDA detektor. Toksinet identificeres ud fra retentionstid og absorbtionsspektrum. Kvantificering af toksinet blev foretaget ved 230 nm.


PSP-toksiner
Selv om musetest er den officielt accepterede metode til detektion af PSP-toksiner, bruges HPLC i stadig højere grad, også i overvågningsprogrammer. I modsætning til analyserne for microcystiner og anatoxiner, detekteres PSP-toksiner med en fluorescensdetektor, idet toksinerne oxideres til fluorescerende derivater. Larsen et al. (1993) beskriver 4 almindeligt brugte HPLC-procedurer, hvoraf 2 (Sullivan & Wekell 1984 og Oshima et al. 1989) er de mest anvendte i Europa. Oshimametoden (Oshima et al. 1989) har de laveste detektionsgrænser og kan detektere det højeste antal toksiner (tabel 1-11). Metoden er enklere end Sullivanmetoden (Sullivan & Wekell 1984, 1986, Sullivan 1990), idet der bruges et enkelt solvent (dvs. isokratisk eluering i modsætning til gradient eluering). Til gengæld kræver den 3 (mod 2) kørsler pr. prøve, fordi STX-toksinerne, GTX-toksiner og C-toksiner kræver hver sit solvent. Dette kan imidlertid afhjælpes ved at opbygge et system, der er i stand til automatisk at skifte mellem de 3 solventsystemer (Ravn et al. 1995). Da målet er at detektere så mange toksiner som muligt, er Oshimametoden at foretrække. Ravn et al. (1995) angiver en række forbedringer af Oshimametoden. I korte træk omfatter proceduren: ekstraktion af toksinerne, injektion i forkolonne, adskillelse af toksiner på kolonne, oxidation af toksiner til fluorescerende derivater i postkolonne, stop af oxidationsproces, detektion i fluorescensdetektor. Metoden er nærmere beskrevet i kapitel 5: Materialer og metoder.

Saxitoxin (STX), dc-saxitoxin (dc-STX), neosaxitoxin (neo-STX) og gonyautoxinerne GTX 1-6 kan i dag fås som kommercielle standarder. Enkelte laboratorier har udviklet deres egne C-toksinstandarder. Sammenlignet med den autoriserede musetest er detektionsgrænsen for HPLC-analyserne lavest -10-30 µg pr. 100 g muslingekød mod 40 µg pr. 100 g muslingekød.

Tabel 1-11
Detekterbare toksiner og detektionsgrænser for PSP-toksiner bestemt med henholdsvis Oshimametoden og Sullivanmetoden.

	Oshima et al. 1989	Sullivan & Wekell 1984
STX	9,0	5
neo-STX	100,0	110
dc-STX	28,0	-
GTX1	17,0	140
GTX2	3,2	5
GTX3	1,3	5
GTX4	41,0	140
GTX5	4,3	55
GTX6	57,0	175
dc-GTX2	3,2	-
dc-GTX3	1,3	-
C1	8,1	6
C2	1,8	6
C3	23,0	-
C4	110,0	-
antal	15,0	10 (12)*

* Metoden er nu udviklet, så den også kan detektere C3 og C4, men detektionsgrænserne er
ikke angivet (Sullivan 1990).

Sammenfatning
Ud over direkte kemisk detektion findes der i dag en række mere eller mindre specifikke assays til detektion af blågrønalgetoksiner. Musetesten har den fordel, at den giver et akkumuleret udtryk for en bade/drikkevandsprøves totale toksicitet testet på et pattedyr. Et problem ved musetesten er, at der skal bruges levende forsøgsdyr, hvilket gør metoden dyr og langsommelig. Desuden får flere og flere lande en lovgivning, der forbyder eller begrænser muligheden for brug af forsøgsdyr. Er der tale om PSP-toksiner, kan musetesten overvurdere toksiciteten. Artemia testen er et andet uspecifikt bioassay, men foreløbig er pålideligheden af denne test ikke verificeret nok, til at den kan bruges som rutinemetode.

Ud over musetest er HPLC, proteinfosfataseassay og ELISA de mest anvendte. Det er hurtige metoder til screening for algetoksiner. Proteinfosfataseassay kan detektere microcystiner, nodularin og okadainsyre, mens der er beskrevet antibody/ ELISA-procedurer til både microcystiner og PSP-toksiner. Et generelt problem med denne type tests er, at der optræder falskpositive og falsknegative reaktioner, dvs. tilfælde hvor assay indikerer toksiner uden, at dette kan verificeres med de kvalitative kemiske analyser og vice versa. Det kan derfor ikke anbefales at bruge disse metoder enkeltstående.

HPLC er i dag den accepterede metode til kemisk analyse af blågrønalgetoksiner. HPLC giver et præcist overblik over de tilstedeværende toksiner. Fordelen ved HPLC-analyser er, at de, når rutinerne er indkørt og udstyr indkøbt, er hurtigere og billigere end musetest. På baggrund af et præcist kendskab til toksinsammensætningen forbedres muligheden for at forudse, hvilke effekter der kan forventes, og hvordan toksiciteten vil udvikle sig. Detektionsgrænserne er lavere end for musetesten. Problemer med HPLC er, at alle toksiner ikke kan bestemmes med den samme procedure (dvs. screening kræver en række kørsler), og at kun toksiner med tilgængelige standarder kan detekteres. Der er derfor risiko for, at metoden ikke giver et billede af prøvens totale toksicitet.