Materialer og metoder, Miljøstyrelsen

5.1 Screening og badevandsundersøgelse

Til screening for blågrønalgetoksiner blev der i sommeren 1994 indsamlet 102 plankton-algeprøver fra 96 lokaliteter på Sjælland, Fyn og i Jylland. Lokaliteter og datoer fremgår af bilag 2-1, 2-2 og 2-3. Prøverne blev indsamlet med et 20 µm planktonnet. Til supplering af undersøgelserne for PSP-toksiner blev der i 1995 indsamlet yderligere kvalitative samt kvantitative prøver fra Agersø, Esrum Å, Søndersø og Bastrup Sø. Desuden blev der indsamlet supplerende kvalitative prøver til musetest fra 2 lokaliteter i Knud Sø henholdsvis den 10. og 13. juli.

Fra alle indsamlede prøver blev en lille delprøve fikseret i sur lugol, og senere brugt til bestemmelse af artssammensætningen ved lysmikroskopi.

Til beskrivelse af årstidsvariationen i toksinforekomst indsamledes 6 gange i 1995 net-prøver af planktonalger i Bryrup Langsø (ved Bryrup) og Ravn Sø (ved Ry). Parallelt med net-prøverne indsamledes kvantitative prøver til bestemmelse af artssammensætning. Prøverne blev udtaget og oparbejdet som beskrevet i Århus Amt (1992a, b).

Alle prøver til toksinanalyse blev ved hjemkomst frysetørret. Algematerialet i de kvantitative PSP-prøver blev først filtreret ned på GF/F-filtre og derefter frysetørret. Testen for toksicitet omfattede musetest (afsnit 5.6), og HPLC-analyser for microcystiner (afsnit 5.3), anatoxin-a (afsnit 5.4) og PSP-toksiner (afsnit 5.5).

5.2 Toksiner i drikkevand

Til undersøgelse af blågrønalgetoksiner i drikkevand blev der indsamlet prøver fra Regnemark og Sjælsø vandværker og fra de 3 søer, der bruges som drikkevandsreservoirer for vandværkerne (henholdsvis Haraldsted Sø, Gyrstinge Sø og Sjælsø). I Haraldsted Sø og Gyrstinge Sø indsamledes planktonprøver med et 20 µm net fra juni 1994 til oktober 1995. Fra Sjælsø indsamledes netprøver i sommeren 1995. Som for badevandssøerne blev artssammensætningen bestemt, og forekomsten af microcystiner og anatoxin-a blev analyseret (se afsnit 5.1, 5.3, 5.4).

Da toksiner kan lække fra algerne til søvandet, specielt i den afsluttende fase af en algeopblomstring, blev toksinforekomsten i vandet i søen samt efter hvert rensningstrin i vandværkerne analyseret. For hvert trin blev der indsamlet 10 l vand.

I Regnemark rensningsanlæg løber vandet først igennem en mikrositromle med maskevidder på 64 og 40 µm. Derefter renses vandet ved en flokkuleringsproces, der binder det organiske materiale, hvorefter det flokkulerede materiale bundfældes i et sedimentationsbassin. Det rensede vand steriliseres med klor (18 mg klor/l). Herefter fjernes kloret igen, og efter en række finfiltre og behandling med monokloraminer (MCA) sendes vandet ud til forbrugerne. Vand blev indsamlet i overfladen af søen, før mikrosien, efter mikrosien, efter sedimentation af det flokkulerede materiale samt fra det færdigbehandlede vand.

I Sjælsø Vandværk består rensningsprocessen af sandfiltrering, flokkulering, sedimentering og ozonbehandling efterfulgt af granulære biologisk aktive kulfiltre samt dosering med MCA. Vand blev indsamlet umiddelbart efter, det var kommet ind på vandværket, efter sedimentering, efter ozonbehandling og efter kulfiltrene.

Da toksinkoncentrationen i vandet normalt er meget lavere end i algerne, blev vandprøverne forbehandlet inden HPLC-analyse. Dette skete ved at filtrere vandet gennem GF/C-filtre (Whatman), så alt partikulært materiale blev fjernet, og herefter opkoncentrere eventuelle toksiner i vandet på Isolute C18-kolonner som beskrevet i tabel 5-1. Ved analyse for anatoxin-a blev pH hævet til 9,5-10 med NaOH før opkoncentrering på Isolute C-18-kolonner. Kolonnerne blev efter opkoncentreringen behandlet som beskrevet i afsnit 5.3 og 5.4. Til microcystin-analyserne blev der taget 3 x 2 l vand og til anatoxin-a-analyserne 3 x 1 l . GF/C-filtrene blev opbevaret ved -20^oC og senere analyseret for toksiner i det partikulære materiale.

På et pilotanlæg på Sjælsø Vandværk blev effektiviteten af vandrensningsprocessen under en simuleret blågrønalgeopblomstring undersøgt. 15 g frysetørret microcystin-holdigt algemateriale (7,5 g fra Bryrup Langsø og 7,5 g fra Birkerød Sø) blev blandet med 2 l vand og udsat for ultralyd (120W) i 30 min afbrudt af kraftig omrystning efter 15 min. Homogenatet fik lov at stå natten over i køleskab for at ekstrahere toksinerne fra cellerne, hvorefter det blev blandet op i 50 l søvand og sendt gennem pilotanlægget. Efter hvert trin i rensningsprocessen aftappedes 6 l vand, der blev GF/C-filteret. Filtrene blev behandlet som beskrevet ovenfor. Det GF/C-filtrerede vand (triplikate 2 l prøver) blev opkoncentreret, som beskrevet i tabel 5-1.

5.3 HPLC-analyser af microcystiner

Analyseudstyr og kemikalier
HPLC-analyser af microcystiner blev foretaget med følgende udstyr:

- Waters 600E pumpe
- Waters 717 plus autoinjector
- Waters 996 Photo Diode Array detector
- Waters Millennium 2.0 software til dataopsamling og -bearbejdning

Standarder af microcystin-LR og -YR stammede fra Calbiochem. Alle solventer var af HPLC-kvalitet og kemikalier af analytisk kvalitet. I alle tilfælde, hvor der blev benyttet vand (vandige buffere, ekstraktion osv.), var dette vand renset på Kinetico Reverse Osmosis Drinking Water System (model # 518), Kinetico, Newbury, USA.

Betingelserne ved analyse af microcystiner er angivet i tabel 5-1. GF/C-filtre fra drikkevands-undersøgelsen (se afsnit 5.2) blev ekstraheret tre gange i 20 ml methanol i 60 min. De 60 ml methanol blev fortyndet med vand til 300 ml og derefter opkoncentreret og analyseret som anført i tabel 5-1. Kvantificering af toksinerne skete på baggrund af arealerne af toksintoppene i kromatogrammer ved 239 nm. Kvantificeringen blev foretaget mod kalibreringskurver for microcystin-LR (ekstern standard).

Tabel 5-1
HPLC-betingelserne ved analyse af microcystiner.

Materiale	ca. 15 mg frysetørret algemateriale afvejet
Ekstraktionsmiddel	1 ml vand efterfulgt af 1 ml methanol
Ekstraktion	ultralyd (120W) i 10 min - afbrudt af kraftig omrystning efter 5 min
Opkoncentrering	efter centrifugering fortyndes supernatanten så methanol-koncentration <20% suges gennem aktiveret C18-kolonne Æ vaskes med 5 ml 20%-methanol Æ elueres med 5 ml methanol Æ inddampning under svag luftstrøm Æ opbevaring i køleskab
C18-kolonne	Isolute C18 (Endcapped, 500 mg/6 ml), aktiveret med 5 ml methanol efterfulgt af 5 ml vand
Injektion	25 µl af inddampede materiale opløst i 400 µl 20% acetonitril og filtreret gennem 0,2 µm (13 mm) membranfilter
Solventer 1994	A: 0,05% trifluoroeddikesyre (TFA) B: acetonitril (indeholdende 0.05% TFA)
Gradient 1994	tid (min) 0 10 20 22 25 A:B % 75:25 66:34 50:50 50:50 75:25
Solventer 1995	A: 10 mM ammoniumacetat (pH 5,0) B: acetonitril
Gradient 1995	tid (min) 0 25.5 32 36 A:B % 78:22 72:28 72:28 78:22
Kolonne	Symmetry C18 (150 x 3.9mm) (Waters)
Flow	1 ml pr. min
Detektion	UV (photo diode array) scanning i bølgelængdespektret 200-300 eller 210-300 nm båndbredde 2,4 nm og 2 dataopsamlinger pr. sekund
Identifikation	spektrum og absorptionstop (239 nm) sammenholdt med standard

Inden proceduren for analyserne blev fastlagt, blev de optimale betingelser for ekstraktion og genfindsprocenten for toksin i frysetørret materiale undersøgt.

Ekstraktionsmetode
For at optimere ekstraktionsprocessen for microcystiner fra frysetørret algemateriale blev toksiske algeprøver fra seks lokaliteter behandlet som beskrevet i tabel 5-2.

Forsøg
Fælles for begge ekstraktionsmetoder var, at algematerialet blev afvejet i hhv. centrifugeglas eller Eppendorf rør, hvorefter ekstraktionsmidlet blev tilsat.

Efter kraftig omrystning placeredes centrifugeglasset/Eppendorfrøret i ultra-lyd. Efter endt ultralyd blev prøverne centrifugeret i 10 min og supernatanten opsamlet. Ekstraktionsproceduren blev gentaget med det tilbageblevne algemateriale. I de tilfælde, hvor der som ekstraktionsmiddel er angivet f.eks. "vand - efterfulgt af methanol" betyder det, at den første ekstraktion blev foretaget med vand og den efterfølgende med methanol.

Efter den anden ekstraktion blev supernatanterne samlet og suget igennem aktiverede Isolute C18 (End-Capped, 500 mg/6 ml) solid-phase extraction kolonner (International Sorbent Technology, Mid Glamorgan, England). Aktivering af kolonnerne skete med 5 ml methanol efterfulgt af 5 ml vand. Prøver ekstraheret i methanol, eller vand efterfulgt af methanol, blev inden opkoncentreringen på Isolute C18 kolonnerne fortyndet med vand til methanol koncentrationen var < 20%.

Efter supernatanterne var suget igennem kolonnerne (flow: 1-2 ml/-min) blev disse skyllet med 5 ml 20% methanol. Toksinerne blev herefter elueret med 5 ml methanol og opsamlet i centrifugeglas.

Indholdet i centrifugeglassene blev inddampet under en svag luftstrøm, og glassene blev placeret i køleskab. Inden HPLC-analyse blev det inddampede materiale genopløst i 400 µl 20% acetonitril og filtreret gennem 0,2 µm (13 mm diameter) filtre.

Tabel 5-2
Ekstraktionsmetoder benyttet til microcystin-analyser.

	Metode 1 (Centrifugeglas)	Metode 2 (Eppendorfrør)
Algeprøver	Akervatn (Norge) 22/10 1984 Halle Sø 27/7 1994 Furesø 21/6 1993 Vejle Sø 29/6 1993 Langesø 25/7 1994 Bryrup Langsø 17/8 1993	Langesø 25/7 1994
Mængde algemateriale	25 mg	15 mg
Ekstraktionsmidler	Vand 5% eddikesyre Methanol Butanol:methanol:vand (1:4-:15) Vand - efterfulgt af methanol (kun Langesø og Bryrup Langsø)	Vand - efterfulgt af butanol:-methanol: vand (kun Langesø og Bryrup La-ngsø) Vand - efterfulgt af methanol Vand - efterfulgt af butanol:-methanol:-vand (1:4:15)
Mængde ekstraktionsmiddel	10 ml	1 ml
Ultralyd 120W	30 min - afbrudt af kraftig om-rystning efter 15 min 10 min - afbrudt af kraftig om-rystning efter 5 min (kun Langesø)	30 min - afbrudt af kraftig omrystning efter 15 min 10 min - afbrudt af kraftig omrystning efter 5 min
Ultralyd 90W		10 min - afbrudt af kraftig omrystning efter 5 min

Prøverne blev analyseret på en NovaPak C18 (Waters) kolonne med følgende solventer og gradient:

Solvent A: 0,05% Trifluoroeddikesyre (TFA)
Solvent B: Acetonitril (indeholdende 0,05% TFA)

Tid (min)	0	5	15	17	20
Solvent A (%)	70	65	50	50	70
Solvent B (%)	30	35	50	50	30

Resultat
De seks algeprøver, som blev benyttet til ekstraktionsforsøgene, havde alle vist tilstedeværelse af levertoksiner ved musetest eller ved HPLC-analyser. Microcystiner i prøverne blev genkendt udfra absorptionsspektrene i de enkelte toppe i kromatogrammerne (figur 5-1).

Figur 5-1
Kromatogram (239 nm) fra Halle Sø den 27. juli 1994. To toppe (I og II) har typiske microcystin absorptionsspektre.

Resultatet af forsøg med forskellige ekstraktionsmidler er afbildet i figur 5-2 og 5-3. Det ses, at det optimale ekstraktionsmiddel varierede for de forskellige algeprøver. Det var karakteristisk, at ekstraktion udelukkende i methanol ofte gav en markant lavere toksinmængde end de øvrige ekstraktionsmidler (figur 5-2 b, d og figur 5-3 a, b).

Figur 5-2
Ekstraktion af microcystiner fra fire algeprøver med forskellige ekstraktionsmidler. Akersvatn indeholdt ét toksin, mens de øvrige indeholdt to. Toksinmængden er beregnet udfra arealet af toksintoppene, således at det maksimale areal fundet i hver algeprøve er sat til 100%. Søjlerne angiver gennemsnit og desuden er angivet minimum og maksimum af tre ekstraktioner. MeOH = methanol, B:-M:V = butanol:methanol:vand (1:4:15 - vol/vol).

Kombinationen butanol:methanol:vand ekstraherede ofte en stor toksinmængde, men for Vejle Sø (figur 5-2 d) gav dette (samt methanol) et omvendt forhold mellem mængderne af de to toksiner i forhold til de vandige ekstrationmidler. På baggrund af dette, samt den gode toksinekstraktion ved anvendelsen af vand efterfulgt af ren methanol, blev ekstraktionsproceduren videre optimeret udfra anvendelsen af vand efterfulgt af methanol.

Figur 5-3
Ekstraktion af microcystiner fra to algeprøver med forskellige ekstraktionsmidler. Som 5-2. V-M = vand efterfulgt af methanol, V-B:M:V = vand efterfulgt af B:M:V.

Figur 5-4 viser resultatet af sammenligning af ekstraktion med vand efterfulgt af ren methanol og af butanol:methanol:vand (1:4:15). Den største mængde toksin fandtes ved ekstrahering af 25 mg algemateriale i 10 ml vand, efterfulgt af methanol, i 30 min ultralyd (120W). Kortere ultralyd (5 min) gav ca. 5% mindre toksin (ikke vist), hvilket svarede til udbyttet ved ekstraktion i 1 ml vand, efterfulgt af methanol, i 10 min ultralyd (120W). Ved metoden med ekstraktion i 1 ml var det karakteristisk, at længere tids ultralyd (30 min) gav et lavere toksinudbytte ligesom anvendelsen af svagere ultralyd (90W).

Ekstraktion af 15 mg algemateriale i 1 ml vand efterfulgt af 1 ml methanol i 10 min ultralyd (120 W) blev valgt til de efterfølgende analyser af blågrønalgeprøver fra danske søer på grund af anvendelsen af mindre mængder algemateriale og ekstraktionsmiddel samt kort prøveforberedelse.

Figur 5-4
Forskellige ekstraktionsmetoders betydning for analyse af microcystinindholdet i frysetørret algemateriale fra Lange Sø den 25. juli 1994. Materialet indeholdt to toksiner. Toksinmængden pr. mg algemateriale er beregnet udfra arealet af toksintoppene, og den maksimale mængde fundet er sat til 100%. Søjlerne angiver gennemsnit og desuden er angivet minimum og maksimum af tre ekstraktioner.

Genfinding af toksin
For at undersøge genfindingsprocenten af microcystin blev en ikke-toksisk blågrønalgeprøve fra Peblinge Sø 24. august 1994 ekstraheret som beskrevet i metode 2 (i vand - efterfulgt af methanol, 10 min ultralyd (120W)) og tilsat 400 ng microcystin-LR samt 400 ng microcystin-YR, inden den blev suget igennem Isolute C18 kolonne. Toksinindholdet i den færdigt behandlede prøve blev kvantificeret mod kalibreringskurver for microcystin-LR og -YR. Som en test af genfindingen af opløst microcystin i vandfasen blev 0,125 µg microcystin-LR sat til 500 ml søvand, og proceduren fra opkoncentrering på Isolute C18-kolonner (tabel 5-1) udført.

Tilsætning af microcystin-LR og -YR standarder til en ikke toksisk algeprøve inden toksin opkoncentrering på C18 kolonne gav følgende genfinding af toksinerne:

	Genfunden toksinmængde (%)
Toksin	Gennemsnit (n = 3)	Minimum	Maksimum
Microcystin-LR	94	89	97
Microcystin-YR	89	86	92

Samtlige kvantificeringer af microcystinindholdet i algemateriale fra søer i 1994 samt søer anvendt til badning i 1995 er baseret på en genfinding af 94% af microcystinerne ved opkoncentrering på C18 kolonner.

Tilsætning af 0,125 µg microcystin-LR standard til 500 ml vand fra Sjælsø (der ikke i forvejen indeholdt toksiner) inden toksin opkoncentrering på C18 kolonner gav følgende genfinding af opløst microcystin i søvand:

	Genfunden toksinmængde (%)
Toksin	Gennemsnit (n = 4)	Minimum	Maksimum
Microcystin-LR	94	88	104

Samtlige kvantificeringer af det opløste microcystinindhold er baseret på denne genfinding (94%).

5.4 HPLC-analyser af anatoxin-a

Analyser af anatoxin-a blev foretaget med følgende udstyr:

- Shimadzu LC-6A pumpe
- Shimadzu SIL-9A autoinjector
- Photo Diode Array detector Shimadzu SPD-M6A
- Shimadzu class-M10A software

Anatoxin-a-standard blev indkøbt hos Calciochem. Alle solventer var af HPLC-kvalitet og kemikalierne af analytisk kvalitet. Det brugte vand var renset med MilliQ Plus 185.

Anatoxin-a blev ekstraheret fra 10 mg frysetørret algemateriale med 10 ml vand i centrifugeglas placeret i ultralyd i 10 min. Både før og midt i ultralydsbehandlingen blev prøven kraftigt omrystet (hvirvelmixer). Efter centrifugering (10 min, 2000 rpm) blev supernatanten taget fra og ekstraktionen gentaget med det resterende materiale. De samlede supernatanter blev tilsat 1-2 dråber NaOH for at hæve pH til 9-10 og umiddelbart derefter suget igennem en aktiveret (5 ml methanol efterfulgt af 5 ml vand) Isolute C18 kolonne (500 mg/6 ml). Toksinet blev elueret med 5 ml methanol indeholdende 0,01% trifloureddikesyre (TFA), og eluatet tørret under luftstrøm. På dette trin kan prøven opbevares forudsat, at den ikke udsættes for sollys.

Inden HPLC-analyse blev prøven opløst i 500 µl 10% methanol. Analyserne blev foretaget på en Develosil C18-5 (150 x 4,6 mm) kolonne (Nomura Chemicals, Japan) med methanol-0.01 M ammoniumklorid (pH justeret til 4 med HCl) (1:9) og flow 1 ml/min. Absorbancen i intervallet 200-250 nm blev registreret til undersøgelse af absorptionsspektre af toppe med retentionstider nær anatoxin-a standarden. For identiske absorptionsspektre (prøvestandard) blev toksinindholdet beregnet ud fra arealet af anatoxin-a-standarden kørt i samme kørsel.

5.5 HPLC-analyser af PSP-toksiner

Analyser af PSP-toksiner blev foretaget med følgende udstyr:

- 3 Shimadzu LC-6A pumper
- Shimadzu FCV-3AL solvent selector
- SIL-6B autoinjector
- Haake D1 and G waterbath
- Haake F3 and W19 waterbath
- Shimadzu Fluorescense HPLC Monitor RF-551
- Shimadzu C-R4A Chromatopac integrator

Standarder af 8 PSP-toksiner (saxitoxin (STX), neo-saxitoxin (neo-STX), dc-saxitoxin (dc-STX), gonyautoxinerne (GTX) 1-5) blev anvendt i projektet. Standarderne var fremstillede af Dr. Y. Oshima, Tohoku University, Japan, og venligt stillet til rådighed for projektet af Dr. Helle Ravn, Danmarks Miljøundersøgelser.

Alle solventer var af HPLC-kvalitet og kemikalierne af analytisk kvalitet. Det brugte vand var renset med MilliQ Plus 185.

Betingelserne ved analyse af PSP-toksiner er angivet i tabel 5-3. HPLC-metoder for PSP-toksiner er tidligere undersøgt i Hav90-projektet "Giftige alger i danske farvande" (Larsen et al. 1993, Ravn et al. 1995), og den valgte metode følger anbefalingerne fra dette projekt. Standarder blev analyseret i starten og slutningen af hver kørsel og til tider midt i en kørsel. Kvantificering skete udfra arealet af toppe med samme retentionstid og maksimumbølgelængde (390 nm), som standarderne (±5%). STX- og GTX-toksinerne blev detekteret i separate analyser.

5.6 Musetests

Frysetørrede algeprøver indsamlet fra en række danske søer i 1994 blev screenet for forekomst af toksiner med musetest. Frysetørret materiale blev opslemmet i 1 ml 0,9% NaCl og injiceret intraperitonealt i hvide mus med en vægt på 19-21 g. To mus fik injiceret ekstrakt af hhv. 50 og 25 mg algemateriale for hver lokalitet. For nogle af lokaliteterne benyttedes tre koncentrationer, hhv. 25 og 12,5 og 5 mg algemateriale pr. ml. I enkelte tilfælde rakte mængden af algemateriale kun til én mus, som så injiceredes med den størst mulige dosis.

Efter injektion af algemateriale blev musene observeret i 3-4 timer. Mus, som døde indenfor denne periode, blev registreret og obducerede for at undersøge forandringer i leverens udseende. Efter ca. 24 timer noteredes hvilke mus, der var døde efter observationsperioden, og overlevende mus blev aflivet.

Musetestene blev udført på Scantox, Lille Skensved.

Tabel 5-3
HPLC-betingelser for detektion af PSP-toksiner ved modificeret Oshimametode (efter Larsen et al. 1993 og Ravn et al. 1995).

Materiale ca. 10 mg frysetørret algemateriale afvejet

Ekstraktionsmiddel 2 ml 0,03 N eddikesyre

Ekstraktion frysning efterfulgt af optøning 3 gange, afsluttende med ultralyd i 2 min og centrifugering 5 min ved 3000 rpm; supernatanten filtreres gennem microfilter MFS-13

Injection 30 µl af ekstrakt, injektionskammer tempereret til 3^oC

Solventer GTX-toksiner:

450 ml destilleret vand tilsat 10,00 ml 100 mM 1-heptannatriumsulfonat og 10,00 ml 500 mM fosforsyrestamopløsning, og justeret til pH = 7,1 med 1 N ammoniumhydroxidopløsning, hvorefter efterfyldes med destilleret vand til 500 ml (højst holdbar 7 dage).

STX-toksiner:

450 ml destilleret vand tilsat 10,00 ml 100 mM 1-heptannatriumsulfonat og 30,00 ml 500 mM fosforsyrestamopløsning, og justeret til pH = 7,1 med 1 N ammoniumhydroxidopløsning, hvorefter efterfyldes med destilleret vand til 500 ml. Derefter tilsættes 30,00

Kolonner forkolonne : LiChroCart RP-18,5, 5 µm

kolonne : Develosil C8-5 (150 x 4,6)

Postkolonne-system pumpe som tilsætter oxidationreagens

teflonslange, hvori reaktion sker, i varmebad*)

pumpe som tilsætter stopreagens efter vandbad

*) temperaturer: GTX-toksiner 65^oC, STX-toksiner 50^oC

Oxidationsreagens til 150 ml destilleret vand tilsættes 5,00 ml 350 mM perjodsyre og 50,00 ml 250 mM dinatriumhydrogenfosfat, og pH indstilles til 9,00 ved titrering med 1 N natriumhydroxidopløsning. Derefter tilsættes destilleret vand til 250 ml (højst holdbar 1 dag).

Stopreagens 0,5 N eddikesyre (højst holdbar 7 dage)

Flow solvent: 0,8 ml pr. min

oxidationsmiddel og stopreagens 0,4 ml pr. min

Detektion fluorescensdetektor, hvor excitationsbølgelængden er 330 nm og emissionsbølgelængden 390 nm.

5.7 Økologiske undersøgelse

Datagrundlag
Analyserne i afsnit 4 er foretaget på grundlag af en række datasæt fra DMU’s forskellige sødatabaser (alle Rdb-databaser på DMU, afd. for Sø- og Fjordøkologi’s VAX-anlæg):

- Data indsamlet i forbindelse med NPO-forskningsprogrammet og her fra specielt datasæt med semikvantitative vurderinger af planteplankton kombineret med kemiske og morfometriske data for søerne. En nærmere beskrivelse af disse data fra mere end 300 søer, 1200 prøvetagninger og 20000 observationer findes i Kristensen et al. (1990b) og Jensen et al. (1994).

- Data fra de 37 søer, der indgår i Vandmiljøplanens overvågningsprogram. Datasæt, der udover kvantitative planteplanktonundersøgelser, omfatter morfometriske data, belastningsdata, fysiske og kemiske undersøgelser af søvandet samt dyreplanktonundersøgelser. De primære data er indsamlet med en årsfrekvens på 17 prøver, og prøvetagningen startede i 1989. For en nærmere beskrivelse se bilag 5-1, Miljøstyrelsen (1993) og Jensen & Søndergaard (1994). Metodikken for planteplanktonundersøgelserne følger anvisningerne i Olrik (1991) og Jensen & Søndergaard (1994).

- Øvrige kvantitative planteplanktonundersøgelser indsamlet i forbindelse med DMU's Afd. for Sø- og Fjordøkologi’s forsknings- og udredningsprojekter samt fra amtskommunale tilsynsundersøgelser. De specifikke data for planteplankton er om muligt kombineret med morfometriske, vandkemiske og -fysiske data. Metodikken for planteplanktonundersøgelserne følger anvisningerne i Olrik (1991) og Jensen & Søndergaard (1994).

- Herudover er benyttet data for vind- og lysforhold samt nedbør fra DMU’s Afd. for Sø- og Fjordøkologi’s klimadatabase. De tilgængelige data har været døgnmiddelværdier på et geografisk detaljeringsniveau svarende til kommuneniveau.

Data for pkt. 3 - Øvrige kvantitative planteplanktonundersøgelser - er udvidet i forbindelse med nærværende projekt. I slutningen af 1994 blev der rettet kontakt til amtskommunerne, som i de fleste tilfælde stillede relevante data til rådighed eller henviste til konsulentfirmaer. Det samlede omfang af databasen med data fra kvantitative planteplanktonundersøgelser er nu 127 søer, 371 søår og 5861 prøvetagningsdatoer (bilag 5-2).

Databehandling og øvrige metoder
Analysen af data er koncentreret om to niveauer: dels et overordnet niveau omfattende toksiske blågrønalger, og dels et mere detaljeret niveau omfattende toksiske slægter og arter af blågrønalger. I analysen er potentielt toksiske arter defineret ud fra litteraturoplysninger om toksiske arter af blågrønalger (Skulberg 1988; Bjergskov et al. 1990; for at analyserne skulle give mening, er slægter og arter med et fuldt datasæt (inkl. kemi og morfometri) og med mere end 15 observationer i den produktive periode (1. maj -1. oktober) valgt ud. Slægten Oscillatoria følger den gamle systematik, det vil sige Oscillatotria er ikke opdelt i de nye slægter: Oscillatoria, Limnothrix, Planktothrix, Pseudanabaena, m.v. Den endelige liste med potentielt toksiske arter, der indgik i analysen, fremgår af tabel 5-4.

Disse potentielt toksiske arter dækker langt hovedparten af blågrønalgeobservationerne registreret i det hele taget; den eneste hyppigt forekommende slægt i databasen, der ikke er med, er Aphanothece (herunder specielt arten: Aphanothece clathrata W. & G.S. West).

Dataanalysen er gennemført parallelt for blågrønalger totalt og for gruppen af potentielt toksiske blågrønalger (tabel 5-4). Resultaterne var ikke forskellige for de to grupper - ikke overraskende, da de potentielt toksiske arter udgør hovedparten af samtlige blågrønalgeobservationer - hvorfor der er vist resultater med henvisning til "blågrønalger" gældende for begge grupperinger.

Tabel 5-4
Potentielt toksiske blågrønalgearter er defineret som følgende slægter, alle hyppigt forekommende i danske søer.
Herunder specielt arten:

Herunder specielt arten:

Coelosphaerium C. kutzingianum Näg.

Gomphoshaeria G. lacustris Chod. (= Snowella lacustris (Chod.) Kom. et Hind.)

G. naegeliana (Ung.) Lemm. (= Woronichinia naegeliana (Ung.) Elenk.)

Microcystis M. aeruginosa (Kütz.) Kütz.

M. incerta (Lemm.) Lemm.

M. viridis (A. Braun.) Lemm.

M. wesenbergii (Kom.) Starm.

Anabaeana A. circinalis Rab.

A. flosaquae (Lyngb.) Breb.

A. lemmermannii P. Richter

A. solitaria Kleb.

A. spiroides Kleb.

Aphanizomenon A. flosaquae (L.) Ralfs

Oscillatoria O. agardii Gom. (= Planktothrix agardhii (Gom.) Anag. et Kom.)

O. rubescens De Candolle (= Planktothrix rubescens (De Candolle) Anag. et Kom.)

Statistiske metoder
Forud for de statistiske analyser blev data (bortset fra pH) logaritmetransformeret for at sikre normalfordeling samt varianshomogenititet. De vigtigste værktøjer ved datapræsentation og analyse har været programpakken SAS (SAS Institute 1989) til almene statistiske og grafiske analyser samt programmet CANOCO (ter Braak, 1988; ter Braak, 1990) ved multivariate analyser samt tilhørende "joint plot".

For at fremme forståelsen af afsnit 4 skal de to begreber: "weighted averaging" og "canonical correspondence analysis" introduceres ganske kortfattet.

Weighted averaging (WA)
Det kan i mange tilfælde være svært eller umuligt at forklare, hvorfor en bestemt planteplanktonart forekommer i en sø i stedet for en anden, men jo større forståelse man har af de enkelte arters økologi (= autøkologi), jo større chance er der for at finde forklaringen(erne). En given planteplanktonart har visse krav til omgivelserne, hvis den skal kunne forekomme og naturligvis i højere grad, hvis den skal kunne dominere i forhold til de øvrige arter og opnå en høj biomasse. En given art har således en flerdimensionel niche bestemt af mange såvel fysisk-kemiske som biologiske faktorer. Eller anderledes sagt: en arts niche udgøres af det "rum", der afgrænses af alle disse faktorer. Dette betyder, at beskrivelse af en arts samlede krav til det omgivende miljø for henholdsvis at kunne forekomme, og kunne dominere, er en utrolig kompliceret om ikke umulig opgave. Dog vil der for en given art ofte være faktorer, der er mere afgørende end andre. Derfor kan en beskrivelse af en planktonarts forekomst i forhold til en enkelt eller få faktorer give væsentlige informationer om den eventuelle betydning af disse faktorer for arten.
-
Ved analyserne er anvendt biomassevægtningsteknikken, dvs. at ved beregningen af gennemsnittet for en arts forekomst tæller forekomster proportionalt til den biomasse, som den har haft ved den givne observation:

u*(p)=(b₁p₁+b₂p₂+.....+b_np_n)/(b₁+b₂+.....+b_n)

hvor u*(p) er det biomassevægtede gennemsnit i forhold til en given variabel (p), b₁,b₂,.....,b_n er biomassen for den givne art for sø 1 til n, og p₁,p₂,.....,p_n er værdien for variablen p i sø 1 til n. Som et mål for variationen omkring det beregnede gennemsnit er spredningen angivet. Således udnyttes ikke kun den information, der findes i registreringen af en given art ved en værdi af en faktor, men også informationen fra biomasseopgørelserne udnyttes. Gennemsnitsværdien kan betragtes som et groft mål for optimumsværdien for arten i forhold til den givne parameter, mens spredningen kan betragtes som et estimat for tolerancen i forhold til parameteren.

WA-teknikken er blevet ganske udbredt efterhånden specielt på grund af dels et forbedret teoretisk grundlag (f.eks. ter Braak, 1987) og dels praktisk anvendelse ved især palæolimnologiske undersøgelser (f.eks. Patrick & Anderson, 1995).

Overgangen fra "weigted averaging"-teknikken til CCA-teknikken er egentlig ganske nærliggende. WA-teknikken giver kun en empirisk beskrivelse af arternes udbredelsesforhold, mens CCA-analysen giver en egentlig statistisk analyse af arternes udbredelse relateret til en række omgivelsesparametre.

Canonical correspondence analysis (CCA)
Notationen er hentet fra Jongman et al. (1987): Data analysis in community and landscape ecology, og ord i parentes er notation herfra. Følgende notation bruges:
Artsvariable (species): Y₁,...,Y_m som hver har en koordinat for hver sø. Artsscores: u₁,...,u_m. Omgivelsesvariable (environmental): Z₁,...,Z_m som ligeledes er observeret i hver sø.

Akserne
Ordinationsakserne i diagrammet er konstrueret som lineære kombinationer af de forskellige omgivelsesvariable, dvs. X=c₀+c₁Z₁+…+c_qZ_q, hvor den i’te søkoordinat i X kaldes for x_i. Førsteaksen er den lineære kombination, som forklarer mest af variationen i arternes score, dvs. den kombination der har den største egenværdi. Andenaksen er kombinationen, som forklarer næstmest artsvariation, og er ukorreleret med førsteaksen. Fortolkningen af en ordinationsakse er uafhængig af en fortolkning af en anden ordinationsakse.

Afbildning af omgivelsesvariable
c’erne (canonical coefficients) i X=c₀+c₁Z₁+…+c_qZ_q er koordinater for den pågældende omgivelsesvariabel, og de afsættes som pile i diagrammet. Jo længere en omgivelsesvariabel peger ud af aksen jo tættere er sammenhængen, så det optimale med hensyn til en enkelt fortolkning er, at en omgivelsesvariabel er sammenfaldende med aksen, dvs. c er 1 (eller -1) og resten af c’erne er nul.

Artskoordinater
En arts aksekoordinat beregnes som et vægtet gennemsnit med hensyn til aksen, og koordinaten er identisk med artsscoren i canonical correspondence analysis. Kaldes artsobservationen i sø nr. i for y_i, beregnes koordinaten som u=y_ix_i/y_i. u’erne afsættes som punkter i diagrammet, og fortolkningen er indirekte gennem omgivelsespilene.

Sammenhængen mellem arter og omgivelsesvariable
En omgivelsesvariabel afsættes som en pil og angiver en retning i diagrammet. Artspunkterne skal fortolkes ved ortogonal projektion på en omgivelsespil. Rækkefølgen af projektionen af artspunkter svarer til rækkefølgen af de vægtede gennemsnit af arterne med hensyn til den pågældende omgivelsesvariabel. I figuren har art 1 større betydningsscore end artsvariabel 2.

En art ved centrum af diagrammet er enten unimodal med optima ved centrum eller ikke relateret til ordinationsakserne. Dette spørgsmål kan afklares via en Monte Carlo permutations test i CANOCO. En art med negativ koordinat til en omgivelsesvariabel behøver ikke at være negativ korreleret til denne variabel, men kan have relativ mindre optimum.