Mikrobiologiske bekæmpelsesmidlers effekter på invertebrater

2. Nontarget invertebrater som testorganismer

2.1 Regnorme
2.1.1 Nematoder og Bacillus thuringiensis
2.1.2 Nematoder og aktinomyceter
2.1.3 Regnorme og mikrobielt betingede sygdomme
2.1.4 Mikrobiologiske bekæmpelsesmidlers indirekte effekter på regnorme
2.1.5 Regnorme og Bacillus thuringiensis
2.1.6 Regnorme og aktinomyceter
2.1.7 Regnorme og Streptomyces griseoviridis
2.2    Nematoder
2.2.1 Nematoder og Bacillus thuringiensis
2.2.2 Nematoder og aktinomyceter

2.1 Regnorme

Allerede klassiske arbejder af Darwin (1881) og danskerne Müller (1878) og Bornebusch (1930) gjorde det klart, at regnorme udgør et meget vigtigt faunaelement i mange terrestriske økosystemer. I disse økosystemer spiller de en betydelig rolle ved (Christensen og Mather, 1994), at

Økologisk betydning

• påvirke jordens fysiske og kemiske egenskaber på adskillige måder (beluftning, vandledningsevne, vandkapacitet, aggregatdannelse, mineralisering af næringsstoffer);
• påvirke planterødder og mikroorganismer, og dermed plantevækst;
• udgøre en væsentlig fødekilde for en lang række dyr, inkluderende alt fra pattedyr til insekter, og dermed overordnet have stor betydning for stof- og energikredsløb.

Med dette som udgangspunkt er det fornuftigt at betragte regnorme som en gruppe af dyr, hvorom det er væsentligt at have et generelt kendskab og specielt i hvilken grad de kan påvirkes af et givent mikrobiologisk plantebeskyttelsesmiddel.

Effekt på regnorme

Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler kan potentielt set påvirke regnorme på flere forskellige måder, såvel direkte som indirekte, og dermed få betydelige konsekvenser for de økosystemer, hvori de anvendes; f.eks.

• reducere antallet og biomassen af regnorme (og/eller ændre deres artssammensætning) og dermed påvirke jordens frugtbarhed i en negativ retning;
• påvirke regnormes vækst og fertilitet og dermed reducere antal og biomasse;
• påvirke predatorer på regnorme ved reduktion i regnormebiomasse.

Regnorme som testdyr

Regnorme har en række egenskaber (Christensen og Mather, 1994), der gør dem ideelle som testorganismer:

• de er almindeligt forekommende i de fleste jorde;
• de er relativt nemme at indsamle og identificere;
• de er relativt nemme at håndtere i laboratoriet;
• en række arter kan dyrkes i kulturer;
• der findes en stor baggrundsviden om deres biologi og økologi;
• de bliver benyttet som testorganismer overfor kemiske pesticider, hvilket betyder, at der eksisterer en erfaring i anvendelse af regnorme som testorganismer.

2.1.1 Regnormene i Danmark

Regnorme er saddelbørsteorme (Oligochaeta), som tilhører ledormene (Annelida). I Danmark forekommer der almindeligt 15 arter fra 9 slægter (Clausen, 1993); de tilhører alle familien Lumbricidae. Se tabel 2.1.

Økotyper

De danske regnorme kan inddeles i tre forskellige økologiske typer efter deres vertikale udbredelse i jordbunden (Bouché, 1972; Lee, 1985, Clausen,1993):

• de epigæiske orme, der lever i relativt uomsatte planterester, førnelag og jordens allerøverste centimetre;
• de anecike orme, der graver dybe gange i jorden, men primært søger deres føde på overfladen;
• de endogæiske orme, der laver gangsystemer i jorden, og primært finder deres føde nede i jorden.

Epigæiske regnorme

De epigæiske orme består af små, hurtigt voksende arter med en kraftig oftest rødbrun pigmentering. De har en relativt kort levetid, men en stor reproduktionsevne. Til gruppen hører D. octaedra, D. rubidus og L. castaneus, arter der primært findes i løvansamlinger, i gødning, i henrådnende træstubbe og grene og lignende steder. Til gruppen hører også E. fetida, som specielt er knyttet til kompost og desuden kan findes i møddinger. Den epigæiske art E. tetraedra findes generelt under meget fugtige omstændigheder.

Anecike regnorme

De anecike orme består af store, langsomtvoksende arter, der oftest er brunligt pigmenterede. De har en lang levetid, men en forholdsvis lille reproduktionsevne. Til gruppen hører L. terrestris og A. longa. Disse arter findes primært på lokaliteter, hvor der tilføres rigelige mængder af organisk materiale til jordens overflade, f.eks. løvskove, græssede overdrev og enge, samt græsplæner.

Endogæiske regnorme

De endogæiske orme er mindre ensartede end de to andre grupper. De omfatter såvel små som relativt store arter, der dog har det fællestræk, at de er upigmenterede eller svagt pigmenterede. De har en temmelig lang levetid og en forholdsvis lille reproduktionsevne. Det fremgår af tabel 2.1 hvilke arter, der hører til denne gruppe.

Krav til økosystem

Regnormenes krav til deres omgivelser hænger naturligvis sammen med hvilken økotype de tilhører. De epigæiske arter er således ret uafhængige af fysisk/kemiske forhold i jorden, men er til gengæld afhængige af tilstedeværelsen af organisk materiale under nedbrydning. De to andre grupper af regnorme, som har en nærmere kontakt med jorden, påvirkes derimod af jordens fysisk/kemiske forhold med forskelle imellem de enkelte arters præferencer og tolerancer. Dette medfører, at forskellige typer af økosystemer ikke blot domineres af forskellige økotyper, men også varierer i artssammensætning (Lee, 1985).

Ernæringsbiologi

Regnorme opdeles også i to forskellige typer med udgangspunkt i deres ernæringsbiologi (Lee, 1985):

• de detritivore regnorme, der primært konsumerer plantemateriale, som kun i nogen udstrækning er nedbrudt;
• de geophage regnorme, der primært konsumerer jord og plantemateriale, der i større udstrækning er nedbrudt.

Dette betyder, at de detrivore regnorme, i den danske fauna, udgøres af epigæiske og anecike arter, mens de geophage udgøres af de endogæiske arter (Clausen, 1993). Se tabel 2.1.

Dyrket jord

Traditionelt dyrket agerjord domineres af endogæiske orme, specielt er A. caliginosa almindelig, men arter som A. rosea og A. chlorotica kan også forekomme (Clausen,1993). På nogle lokaliteter vil de to anecike arter L. terrestris og A. longa også kunne findes (Andersen, 1987). Regnormenes antal varierer fra ganske få individer til flere hundrede pr. m² (Andersen 1983, 1987). Der findes ikke internationalt publicerede undersøgelser over regnormefaunaen i økologisk dyrket agerjord, men det må forventes, at anecike og epigæiske orme er mere almindelige end i den traditionelt dyrkede jord, og at antallet af individer er højere, fordi der anvendes forskellige former for organisk gødning, og fordi jorden bearbejdes mindre.

Tabel 2.1
Almindeligt forekommende regnormearter i Danmark

Økotyper: En: Endogæisk, An: Anecik, Ep: Epigæisk.
Ernæringstyper: Geo: Geophag; De: Detritivor.
Danske navne efter Bornebusch (1928).

I intensivt drevne gartnerier, hvor der ikke anvendes kompost eller lignende, forventer vi, at regnormefaunaen primært består af endogæiske arter i et relativt begrænset antal. I dyrkningssystemer, hvor der anvendes kompost og jorddække, vil epigæiske og anecike regnorme have gode livbetingelser, og derfor sandsynligvis findes som betydelige populationer. I frugtplantager findes ofte en stor population af den anecike art: L. terrestris (Lee, 1985).

Overdrev og enge

Anecike og endogæiske arter er de dominerende på overdrev og enge, mens artssammensætning sandsynligvis er afhængig af jordens fysisk-kemiske forhold. Under dyregødning (f.eks. kokasser) findes også epigæiske arter, samt de to overgangsformer (se tabel 2.1) L. rubellus og L. festivus (Holter 1979, 1983; Hendriksen, 1991). Individantallet og biomassen er ofte høj.

Løvskove

I løvskove på muldjord findes alle tre økotyper af regnorme ofte i et stort antal med en høj biomasse og en stor artsdiversitet. Derimod er det hovedsageligt epigæiske orme af arterne D. octaedra, D. rubidus og L. rubellus, i et begrænset antal, der findes i løvskove på morbund (Clausen, 1993). I nåleskove findes der et meget begrænset antal regnorme, primært den epigæiske art D. octaedra (Bornebusch, 1930).

Fysiske krav

Regnormes aktivitet er bestemt af jordens temperatur og fugtighedsforhold. De fleste danske arter er aktive ved temperaturer imellem ca. 0° og 25°C, så længe jorden er tilstrækkelig fugtig. Dette betyder, at regnormene i danske økosystemer primært er aktive i forårs og efterårsmånederne samt i den tidlige og sene sommertid. Hvis jorden er ved at tørre ud eller temperaturerne falder til under 0°C vil ormene enten grave sig ned i dybere liggende jordlag eller forsøge at overleve i en inaktiv tilstand (Edwards og Lofty, 1977; Andersen, 1987).

2.1.2 Regnorme og mikroorganismer

Regnorme lever i et miljø, hvor de er omgivet af et utal af mikroorganismer med en særdeles stor artsdiversitet. Litteraturen har hovedsagligt beskæftiget sig med mikroorganismernes interaktioner med regnormenes fordøjelsessystem. Figur 2.1 anskueliggør de forskellige typer af interaktioner.

Figur 2.1

Interaktioner imellem regnormes fordøjelsessystem og mikroorganismer.

1. Mikroorganismer i føde
2. Mikroorganismer som lysereres i kro/tyggemave
3. Mikroorganismer med enzymer der medvirker ved nedbrydning
4. Mikroorganismer der passerer ind i tarmen
5. Mikroorganismer der går upåvirkede igennem tarmen
6. Mikroorganismer der lyseres i tarmen
7. Mikroorganismer der aktiveres
8. Mikroorganismer der deler sig
9. Midlertidigt residerende mikroorganismer
10. Residerende mikroorganismer
11. residerende mikroorganismer som koloniserer tarmmateriale
12. Mikroorganismer i fæces.

Fordøjelsessystem

Regnorme konsumerer materiale, som indeholder varierende koncentrationer af mikroorganismer (1). Det konsumerede materiale blandes i kro og tyggemave med vand, slim, enzymer og måske antibakterielle faktorer. Dette medfører, at nogle mikroorganismer lyseres og sandsynligvis optages i tarmen (2); nogle af disse mikroorganismers enzymer kan medvirke ved nedbrydning af specifikke organiske komponenter i tarmen (3). Andre mikroorganismer vil overleve opholdet i den forreste del af fordøjelsessystemet og blive transporteret frem i tarmen (4). Disse kan: (5) gå upåvirkede igennem tarmen og blive udskilt med fæces, (6) blive lyseret og optaget af tarmen, (7) blive aktiveret fra en mindre til en mere aktiv tilstand, (8) dele sig, (9) eller fæstne sig til tarmvæggen i længere eller kortere tid, og eventuelt dele sig her (midlertidigt residerende mikroorganismer). Den mikrobielle produktion, der opnås ved vækst (8 & 9), kan blive lyseret og absorberet og/eller blive udskilt med fæces. I tarmen kan der også findes residerende mikroorganismer, som danner permanente, relativt stabile populationer. De kan være permanent fæstet til tarmvæggen (10) eller kunne kolonisere tarmmaterialet (11); disse bakterier vil i en vis udstrækning blive udskilt med fæces.

Mikrofloraen i fæces (12) vil således kunne bestå af: Mikroorganismer der går upåvirkede igennem fordøjelsessystemet (5); mikroorganismer der er blevet aktiveret (6); mikroorganismer der har delt sig og sandsynligvis dermed er blevet forøget i antal (8); samt residerende mikroorganismer, der har koloniseret tarmindholdet (9, 11). Disse forskellige grupper af mikroorganismer vil findes i en blanding, der vil afhænge af hvilke mikroorganismer, der er blevet konsumeret, og deres skæbne i tarmen.

I det følgende vil det blive beskrevet hvilken evidens, der findes for de forskellige typer af relationer imellem regnorme og mikroorganismer, og eksempler på hvilke mikroorganismer, som er kendt for at udvise det beskrevne respons, vil blive givet.

Mikroorganismers skæbne

En række mikroorganismer reduceres betydeligt i antal (mere end en faktor 100) under ophold i regnormes fordøjelsessystem (2), f.eks. mange svampehyfer (Domsch og Banse, 1972; Dash et al., 1979), de gram-negative-bakterier Eschericia coli (Brusewitz, 1959; Pedersen og Hendriksen, 1993), Serratia marcessens (Day, 1950) og Pseudomonas putida MM11 (Pedersen og Hendriksen, 1993) samt den gram-positive bakterie Bacillus mycoides (Day, 1950). Denne antalsmæssige reduktion, der sandsynligvis primært forårsages af en lysering af cellerne, synes primært at foregå i den foreste del af fordøjelsessystemet (Pedersen og Hendriksen, 1993). Det er ikke specifikt dokumenteret for regnorme, at nogle af de lyserede organismers proteolytiske enzymer medvirker ved nedbrydning af specifikke komponenter i tarmen (3); men det er kendt fra en række andre invertebrater (Martin, 1983), og resultater angående specifikke enzymers tilstedeværelse i tarmen hos den tropiske art Pontoscolex corethrurus (Zhang et al., 1993) giver en betydelig indirekte evidens herfor.

Effekt på sporer

Det er primært sporer af såvel bakterier som svampe, der går upåvirkede igennem fordøjelsessystemet (5) (Brown, 1995), men også bakterien Aeromonas hydrophila (Pedersen og Hendriksen, 1993), som ikke danner sporer, blev ikke antalsmæssigt påvirket af passagen; dette kan dog være et nettoresultat af en kombination af bakteriel vækst og død i tarmen. Tilsvarende synes nogle bakterier i mindre aktive tilstandeat gå upåvirkede igennem tarmen (Fischer et al., 1995). Det er derimod kun dokumenteret med sikkerhed for P. fluorescens KTG (Clegg et al., 1995), at der sker et betydeligt fald i antal i selve tarmen (7).

Aktivering ved tarmpassage

Det er ikke dokumenteret for en enkelt stamme af mikroorganisme, at den bliver aktiveret fra en mindre til en mere aktiv tilstand under tarmpassagen; men en række forhold taler for, at det er tilfældet for en række bakterier: (a) bakteriers dyrkbarhed forøges uden, at der samtidig sker en forøgelse i biomasse eller antal opgjort ved direkte tællinger (Daniel og Anderson, 1991; Pedersen og Hendriksen, 1993); (b) den mikrobielle respiration forøges i fæces uden en korresponderende forøgelse i biomasse (Scheu, 1987) og (c) antallet af detekterbare bakterier, opgjort ved hjælp af rRNAprober, forøges uden en tilsvarende forøgelse ved direkte tælling (Fischer et al., 1995).

Flere undersøgelser beskriver, at der sker en betydelig vækst af mikroorganismer i regnormes fordøjelsessystem (8), primært af bakterier og aktinomyceter (Brown, 1995). Men da de fleste undersøgelser ikke på en overbevisende måde opgør antallet af mikroorganismer i det konsumerede materiale, og ikke tager højde for en eventuel lysering i tarmsystemets forreste del og ikke tager hensyn til en reaktivering i tarmen, er det vanskeligt at benytte denne evidens som udtryk for en reel vækst i regnormes tarm. Pedersen og Hendriksen (1993) sandsynliggør dog, at der sker en vækst af bakterien Enterobacter cloacae imellem fortarm og bagtarm.

Mikroorganismer i tarm

Det er sandsynligt, at der eksisterer residerende mikroorganismer i regnorme (10, 11), da Máriaglieti (1979) og Contreras (1980) overvejende fandt bakterier fra slægten Vibrio og aktinomyceten Streptomyces lipmanii i tarmmateriale fra E. lucens. Desuden fandt Jolly et al. (1993) og VinceslasAkpa og Loquet (1995) segmenterede filamentøse mikroorganismer fasthæftet til bagtarms epitelet af O. cyaneum, L. terrestris og E. foetida; disse organismer er ikke blevet bestemt, men ligner morfologisk, hvad der findes hos rotter og mus og dér kaldes segmenterede filamentøse bakterier. Henschke et al. (1989) giver evidens for, at bakterier også kan danne midlertidigt residerende populationer i tarmen, idet de kunne detektere P. fluorescens DSM 50148 i fæces fra L. terrestris 50 døgn efter, at den var blevet konsumeret.

Mikroorganismer i fæces

Mikrofloraen i fæces er primært blevet betragtet, som værende en afspejling af de mikroorganismer, der findes i det konsumerede materiale (Brown, 1995; Satchell, 1983; Edwards og Fletcher, 1988). De mange forskellige relationer der eksisterer imellem regnormes fordøjelsessystem og mikroorganismer, sandsynliggør, at dette er en alt for simpel betragtning af denne mikroflora. Efter defækation synes der først at ske en betydelig bakteriel vækst efterfulgt af en vækst af svampe (Brown, 1995; Satchell, 1983; Fletcher og Edwards, 1987).

Mikroorganismer på orme

Det er dog ikke kun regnormenes fordøjelsessystem, der kan påvirke mikroorganismer. Fra ormenes overflade udskilles slim, som indeholder labile organiske forbindelser, der kan fremme mikrobiel vækst, og deres ekskretionsprodukter indeholder mobiliserede næringsstoffer, der ligeledes vil påvirke mikroorganismerne (Scheu, 1991; Lee, 1985). Det er endvidere blevet sandsynliggjort, at Flavobacterium sp. og P. cepacia kan blive transporteret rundt i jord på regnormes overflade (Heijnen og Marinissen, 1995). Desuden vil regnormenes graveaktivitet og specielt de anecike regnormes transport af organisk materiale fra overfladen ned i jorden have en stor betydning for mikroorganismernes aktivitet (Hendriksen, 1996; Devliegher og Verstrate, 1995; Winding et al., submitted).

Mikroorganismers spredning

Relationerne imellem regnorme og mikroorganismer antyder kraftigt, at regnorme kan have stor betydning for specifikke mikroorganismers overlevelse og spredning i jorden. Det er da også blevet vist, (1) at regnorme kan påvirke spredningen af en række plantepatogene mikroorganismer (Brown, 1995), (2) spredning og dermed sygdomsbekæmpelseseffektivitet af P. corrugata 2140R (en bakterie der kan bruges til bekæmpelse af svampesygdommen »Take-All«) (Doube et al., 1994), (3) spredning og noduleringseffektivitet af rhizobier (Doube et al., 1994), samt (4) spredning og overlevelse af A. hydrophila (Hendriksen, 1995).

De mange forskellige interaktioner imellem regnorme og mikroorganismer, ikke mindst i deres fordøjelsessystem, må have en afgørende betydning for den enkelte mikroorganismes muligheder for at påvirke regnorme i en negativ retning. Det har dog ikke været muligt at finde undersøgelser som belyser samspillet imellem disse interaktioner og mikroorganismers patogene egenskaber.

2.1.3 Regnorme og mikrobielt betingede sygdomme

Patogen typer

Mikroorganismer kan være patogene overfor regnorme, dvs. de kan invadere regnorme og forårsage sygdom. Mikroorganismer er meget forskellige med hensyn til patogenecitet (evne til at forårsage sygdom). Dette kan dels skyldes forskelle i evnen til at invadere regnormene (trænge ind i regnormenes kropshule og/eller celler) og dels forskelle i deres evne til at være aktive i regnormes kropshule. Mikroorganismer kan opdeles i potentielle, fakultative og obligate patogener. Potentielle patogener er mikroorganismer, som kan invadere værten, uden at værten af andre årsager er svækket; mens fakultative patogener kan invadere værten, hvis den af andre grunde allerede er svækket. Såvel potentielle som fakultative patogener kan overleve og dele sig udenfor værterne, og de kan derfor også dyrkes på kunstige medier. Obligate patogener er derimod helt afhængige af levende celler for at overleve, dele sig og være patogene. (Afsnittet er baseret på Tanada og Kaya, 1993). Meget lidt er reelt kendt angående mikroorganismers patogenecitet overfor regnorme.

Figur 2.2

Mulige invasionsveje i regnorme for mikroorganismer

1. Vægge i fordøjelsessystemet
2. Epidermis
3. Dorsalporer
4. Nephridieporer
5. Kønsporer
6. Kokoners dannelse

Invasionsveje

Dales og Kalaç (1992) definerer mikroorganismer, der er patogene for regnorme, som mikroorganismer, der kan trænge ind i coelomet, reproducere sig og danne en blivende population i coelomvæsken. Fig. 2.2 anskueliggør de forskellige invasionssveje, der må findes hos regnorme. Mikroorganismer kan blive konsumeret og invadere selve regnormen over tarmvæggen (1). Andre mikroorganismer kan ved hjælp af enzymer penetrere epidermis og på den måde trænge ind i ormen (2). På regnormes overflade findes åbninger ind til coelomhulen (dorsalporer (3) og nephridieporer (4)), hvorigennem mikroorganismer kan trænge ind. Desuden kan kønsorganerne invaderes igennem kønsporerne (5). En invasion af regnormenes kokoner kan tænkes primært at foregå under kokonernes dannelse (6). Af disse invasionsveje er kun tarmvæggen blevet dokumenteret som en sandsynlig invasionsvej til coelomet (Dales og Kalaç, 1992, Smirnoff og Heimpel, 1961). I coelomvæsken, primært fra E. fetida, er en række forskellige hemolytiske, hemoagglutinerende og antibakterielle molekyler, samt celler med fagocytotiske egenskaber blevet identificeret (Valembois et al. 1986; Dales og Kalaç, 1992). Disse faktorer udgør et forsvarssystem imod bakterielle infektioner. På samme måde er der blevet isoleret bakterier fra kokoners lumen; i dette tilfælde også bakterier der er blevet udsat i den omgivende jord (Zachmann og Molina, 1993); disse bakterier vil sandsynligvis kunne invadere kokonen under dens dannelse, som det er blevet postuleret for parasitiske mider (Gjelstrup og Hendriksen, 1991). Vækst i coelomvæsken er dels betinget af mikroorganismens mulighed for at dele sig, dels af regnormes forsvarssysstems mulighed for at bekæmpe organismen, hvilket synes betinget af ikkespecifik phagocytose, som bliver hjulpet af forskellige antimikrobielle faktorer, samt muligvis af stoffer med opsoninlignende egenskaber (Dales og Kalaç, 1992). Mikroorganismer med patogene egenskaber synes således, at blive phagocyteret med en lavere hastighed end ikkepatogene mikroorganismer (Dales og Kalaç, 1992).

Mikrobielle toksiner

Mikroorganismer kan også forårsage sygdom ved at danne stoffer, som er toksiske overfor organismen. I sådanne tilfælde er det ikke en nødvendig forudsætning for virkningen, at mikroorganismen invaderer organismen. Toxinet kan enten blive produceret og/eller tilført regnormens omgivelser eller blive produceret i regnormenes fordøjelsessystem og derfra påvirke organismen. Definitionsmæssigt findes der to forskellige typer af toxiner: (1) de anaboliske toksiner, som er stoffer, der produceres af selve mikroorganismen og (2) kataboliske toksiner, der produceres som en funktion af mikroorganismens nedbrydning af substrat, f.eks kan nedbrydning af kulhydrat medføre dannelse af toksiske alkoholer.

Infektiv dosis

En enkelt celle fra en mikroorganisme kan principielt skabe en infektion, men generelt set er dette meget sjældent tilfældet. I stort set alle tilfælde vil det kræve et minimum af infektive mikroorganismer, som invaderer organismen, før de forårsager en infektion. Denne infektive dosis udtrykkes ofte kvantitativt som letal dosis (LD), effektiv dosis (ED), eller infektiv dosis (ID) (Tanada og Kaya, 1993). Disse begreber er reelt endnu ikke taget i anvendelse i relation til regnorme.

Symptomer

Efter en mikroorganismes invasion af en regnorm, og efterfølgende etablering, kan infektionen deles i følgende faser: inkubationsperioden, sygdommens udbrud, sygdommens højdepunkt og sygdommens ophør. Inkubationsperioden strækker sig fra regnormen er blevet invaderet til de første tegn på sygdom er synlige. Sygdommens udbrud er tidspunktet, hvor de første tegn på sygdommen bliver synlige. Sygdommens højdepunkt er den periode, hvor regnormen udviser de maksimale tegn på sygdommen. Sygdommen kan enten blive kronisk eller afsluttes ved at ormen dør eller den bliver rask. Tegnene på sygdom kan enten være karakterer der er (1) morfologisk erkendelige f.eks. pletter, blodudtrædninger, indsnøringer og lignende, (2) være erkendelige ved dyrenes aktivitet, (3) nedsættelse af vækstrate og/eller (4) fertilitet (kokonproduktionsrate) eller (5) død.

Tabel 2.2
Mikroorganismer med patogene egenskaber overfor regnorme

Patogene mikroorganismer

Kun ganske få mikroorganismer er dokumenteret patogene overfor regnorme. Tabel 2.2 er en oversigt over de af os kendte eksempler. Det fremgår af tabellen, at den kun omfatter bakterier, men såvel grampositive som gramnegative. De første ti eksempler er bakterier, der kan forårsage død hos regnorme (primært E. fetida) ved injektion af bakterierne i coelomvæsken; det er ikke blevet undersøgt hvorvidt disse bakterier kan inficere regnorme på en mere naturlig måde. Hendriksen (1995) og Pedersen og Hendriksen (1993) har foretaget fodringsforsøg med A. hydrophila, de fandt ingen effekter på regnormene, så dette kan betyde, at der enten er forskelle imellem forskellige stammer af bakterierne eller at A. hydrophila ikke er invasiv. B. thuringiensis synes at kunne invadere coelomet efter konsumption og derved forårsage død. E. aerogenes er den eneste mikroorganisme, hvorom det med stor sikkerhed kan siges, at den er patogen overfor regnorme (den tropiske art Hoplochaetella suctoria), idet en grundig undersøgelse har kundgjort, at E. aerogenes opfylder alle fire betingelser (Koch's postulater) for at kunne etablere en kausal sammenhæng imellem sygdom og mikroorganisme: (1) Den specifikke mikroorganisme skal kunne isoleres fra samtlige tilfælde af sygdommen; (2) mikroorganismen skal kunne dyrkes i kultur; (3) mikroorganismen skal kunne give ikke syge organismer sygdommen eksperimentelt (smitteoverførsel); og (4) mikroorganismen skal også kunne isoleres fra de eksperimentelt smittede organismer (Tanada og Kaya, 1993). En patogen hyphomycet Exophiala jeanselmei er blevet isoleret fra naturligt inficerede O. tyrtaeum og E. foetida kokoner, og det er blevet vist eksperimentelt, at den kan inficere kokoner fra seks forskellige arter af regnorme (Vakili, 1993).

2.1.4 Mikrobiologiske bekæmpelsesmidlers indirekte effekter på regnorme

Mikroorganismer kan påvirke regnorme indirekte ved at influere på faktorer, der har afgørende betydning for regnormes livsprocesser. Det kan f.eks. være: (1) produktion af kataboliske toksiner, (2) produktion af antibiotika, der påvirker den mikrobielle samfundsstruktur og dermed regnormes levevilkår, (3) påvirkning af nedbrydningsprocesser og stofkredsløb. Der findes ikke undersøgelser, der belyser en eller flere af disse problemstillinger.

2.1.5 Regnorme og Bacillus thuringiensis

Et mindre antal undersøgelser har beskrevet B. thuringiensis effekt på regnorme, men det er ikke muligt at drage endelige konklusioner angående denne bakteries patogenecitet overfor regnorme. Der findes dog en række indicier for, at B. thuringiensis kan påvirke regnorme, muligvis ved at være patogen.

»Blisterdisease«

Heimpel (1966) isolerede to stammer af B. thuringiensis fra E. foetida fra regnormekulturer, som udviste en »blister-disease«. En sygdom der øjensynligt fører til massedød i kulturerne. Stammerne blev begge henført til B. thuringiensis subsp. thuringiensis. Isoleringen af disse to stammer blev dog ikke fulgt op af eksperimentelle undersøgelser, som kunne have eftervist, hvorvidt disse isolater forårsagede sygdommen. Der mangler således en eksperimentel eftervisning af Koch's postulater. Çotyk og Dales (1984) injicerede dog en af stammerne i E. fetida i relativt høje koncentrationer (9 x 10⁶/ml) uden at det forårsagede død; dette kan skyldes en række forskellige årsager, som ikke nødvendigvis er knyttet til bakteriens patogene egenskaber: F.eks. forskelle imellem forskellige populationer af E. fetida's respons, at stammen af B. thuringiensis har ændret sig ved gentagne opformeringer i kultur, eller at sporer og vegetative celler af B. thuringiensis giver forskelligt respons hos ormen.

B. t. subsp. Thuringiensis

Smirnoff og Heimpel (1961) undersøgte eksperimentelt effekten af det mikrobiologiske bekæmpelsesmiddel Thuricide, som indeholder B. thuringiensis subsp. thuringiensis, på L. terrestris. De fandt, at høje ikke realistiske koncentrationer (120 vægt%) Thuricide iblandet jorden, svarende til ca. 4x10⁸ 8x10⁹ B. thuringiensis/g jord, alle medførte 100% mortalitet i løbet af ca. 2 måneder, selv ved den laveste påvirkning. Histologiske undersøgelser af de døde orme viste, at B. thuringiensis invaderede coelomet via tarmvæggen og forårsagede død på grund af blodforgiftning. Krieg (1983; citeret i Addison (1993)) foreslår dog, at invasionen ikke var forårsaget af selve bakterien, men af diatoméjorden som blev benyttet som bærestof i formuleringen af Thuricide.

B. t. subsp. Galleriae

Atlavinyte et al. (1982) undersøgte eksperimentelt effekten af det mikrobiologiske bekæmpelsesmiddel Entobacterin, som indeholder B. thuringiensis subsp. galleriae, på A. caliginosa. Deres resultater er desværre tvetydige. De fandt således i ét eksperiment at Entobacterin ingen eller ringe effekt havde på ormene, mens det i at andet eksperiment havde en effekt på såvel overlevelse som vækst. Effekten var især udtalt med koncentrationer svarende til ½ og 1 gange feltdosis, mens 2 gange feltdosis havde en ringe effekt. Det blev ikke undersøgt, hvorvidt bakterien inficerede ormene. Det blev derimod vist, at mellemkoncentrationerne af Entobacterin negativt påvirkede parametre som nedbrydningsraten af halm, tæthederne af mider, collemboler, insektlarver og mikroorganismer (opgjort ved pladespredning) og visse jordbundskemiske parametre. Dette kunne antyde, at den viste effekt på A. caliginosa af Entobacterin snarere er en indirekte effekt end en mere direkte.

Der er endvidere blevet gennemført et par feltundersøgelser vedrørende B. thuringiensis effekt på regnorme (White, 1961 (citeret i Benz og Altweg, 1975); Benz og Altweg, 1975). Ingen af disse undersøgelser er gennemført på en sådan måde, at det er muligt at give en biologisk meningsfuld fortolkning af resultaterne, da de ikke angiver hvilke regnorme (økotyper), der er blevet fundet på lokaliteterne, og det dermed ikke kan vurderes, hvorvidt ormene reelt har været eksponeret for bakterierne.

B. thuringiensis i fæces

Hendriksen (upubl.) fandt B. thuringiensis (identificeret v.h.a. kolonimorfologi og tilstedeværelse af krystaller) i fæces fra følgende arter af aktive regnorme indsamlet på forskellige lokaliteter: L. rubellus, L. festivus, L. terrestris, A. caliginosa, A. chlorotica, A. longa og O. cyaneum. Forekomsten var mest talrig i de endogæiske arter. Dette antyder, at der forekommer stammer af B. thuringiensis i det materiale, som regnorme konsumerer, og at denne forekomst ikke umiddelbart synes at påvirke regnormene.

B. thuringiensis varianter

Da der findes mange forskellige underarter af B. thuringiensis, som producerer d-endo-toxiner med forskellige egenskaber (Ellar, 1990), og da det enkelte isolat desuden kan producere en række andre stoffer med toksiske egenskaber, primært i den vegetative vækstfase (Hansen et al., 1996), er det meget sandsynligt, at der vil være stor variation imellem forskellige underarters og isolaters effekt på regnorme. Dette forhold kompliceres yderligere af, at det ikke med udgangspunkt i den tilgængelige viden er muligt at afgøre hvilke forhold (d-endo-toksiner, andre toksiner, indirekte effekter) som er involveret i B. thuringiensis mulige effekt på regnorme.

2.1.6 Regnorme og aktinomyceter

Aktinomyceter er ofte blevet isoleret fra tarmmateriale fra regnorme (Brown, 1995); og det er sandsynligt, at nogle aktinomyceter kan vokse i tarmmiljøet (Parle, 1963). Især er forekomsten af aktinomyceter knyttet til regnorme blevet studeret i Centraleuropa (Contreras, 1980; Kristufek et al. 1990; Ravasz og Toth, 1990; Kristufek et al., 1993). Disse undersøgelser viser, (1) at det blandt aktinomyceterne især er arter fra slægten Streptomyces, der er almindeligt forekommende i tarmmaterialet, (2) at Streptomyces arterne der findes i regnormene oftest også er almindelige i jorden, men at forholdet imellem arterne varierer imellem regnorme og jord, (3) at der er forskel i Streptomycet-floraen imellem forskellige arter af regnorme, hvilket især synes knyttet til forskelle i økotyper, (4) at nogle få Streptomycet arter måske kan danne residerende populationer i tarmen hos regnorme.

2.1.7 Regnorme og Streptomyces griseoviridis

Streptomyces griseoviridis er ikke blandt de isolater som er blevet isoleret og identificeret fra regnorme (adskillige hundrede isolater) (se ovenfor).

Det er, så vidt vides, aldrig blevet undersøgt, hvorvidt aktinomyceter kan påvirke regnorme i en negativ retning (være patogene eller på anden måde påvirke regnorme). Det er således ikke muligt med baggrund i litteraturen at udtale sig om, hvorvidt S. griseoviridis har potentiale for at have negative effekter på regnorme. Streptomyceter synes dog ikke at være stærkt virulente overfor invertebrater, da der ikke er beskrevet sygdomstilfælde hos invertebrater, der er sat i forbindelse med infektion med en art af Streptomyces (KornWendisch og Kutzner, 1992). Med udgangspunkt i dette, og S. griseoviridis antibiotiske egenskaber (Lübeck, 1994), så synes indirekte effekter mere sandsynlige end direkte patogene effekter.

2.2 Nematoder

Diversitet

Nematoder kan ikke på samme måde som regnorme betragtes som en gruppe af dyr med en relativt ensartet effekt på økosystemer. Nematoder er en dyregruppe, der indeholder arter, som regnes for at være skadedyr (en række parasitære arter på såvel højere dyr som planter). Nematodarter, der parasiterer artropoder og mollusker, kan anvendes til biologisk bekæmpelse af en række forskellige arter af disse invertebrater og udnyttes i denne forbindelse kommercielt. Gruppen indeholder også en lang række fritlevende arter, der kan have andre mere gavnlige effekter på økosystemers funktion.

Funktion

De fritlevende nematoder udgør imellem en og ti millioner individer/m² i de allerfleste terrestriske økosystemer (Nicholas, 1975), hvor deres biologiske rolle er at indgå i den terrestriske detritusfødekæde på flere forskellige niveauer og ved at påvirke mineralisering af næringsstoffer (Griffiths, 1994). De fritlevende nematoder er en yderst divers gruppe af dyr, der dels er vidt forskellige i en taksonomisk sammenhæng, dels har en meget forskelligartet ernæringsbiologi. Der kan f.eks. skelnes imellem bakterieædere, svampeædere, algeædere, rodsugere, predatorer og nematoder med et blandet fødeindtag (Nicholas, 1975). Nematoders forekomst og økologi i Danmark er øjensynligt ikke blevet undersøgt siden Nielsen (1949). Det må forventes, at den danske nematodfauna omfatter adskillige tusinde arter.

Derimod påvirker nematoder, i modsætning til regnorme, ikke direkte jordens kemiske og fysiske egenskaber, da de på grund af deres ringe størrelse ikke har jordbundsdannende egenskaber, som det er tilfældet med regnorme.

Effekt på nematoder

Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler kan potentielt set påvirke nematoder på mange forskellige måder, f.eks. ved at reducere antallet (enten direkte eller ved nedsat vækst og fertilitet) og/eller ved at ændre artssammensætningen og dermed påvirke detritusfødekæden.

Nematoder som testdyr

Nematoder har nogle egenskaber, der gør dem fornuftige at benytte som testorganismer i denne sammenhæng:

• de er almindeligt forekommende i de fleste jorder;
• de er relativt simple at indsamle;
• en række arter kan holdes i kultur, såvel xenisk som axenisk;
• mange arter har en relativ kortvarig livscyklus, hvilket gør det nemmere at studere vækst og frugtbarhed.

Men desværre er der også en række egenskaber, der gør dem mindre egnede som testorganismer:

• det er en meget divers gruppe af dyr, bestående af mange arter, med mange forskellige typer af biologi;
• det er yderst vanskeligt at identificere nematoder;
• kendskabet til de fritlevende nematoders taxonomi, udbredelse, biologi og økologi er begrænset.

2.2.1 Nematoder og Bacillus thuringiensis

En række undersøgelser har klargjort, at der kan forventes en vis grad af påvirkning af nematoder ved anvendelse af B. thuringiensis. Repræsentanter for både fritlevende-, planteparasitiske- og zooparasitiske nematoder har vist sig, et eller flere steder i deres livscyklus at være følsomme, i større eller mindre grad, over for visse B. thuringiensis stammer.

Effekt på nematoders æg

En række rapporter peger på, at B. thuringiensis d-endotoksiner kan være toksiske især over for nematoders æg. Bottjer et al. (1985) undersøgte in vitro effekten af 30 sporulerede B. thuringiensis varieteter på æg fra den zooparasitiske Trichostrongylus colubriformis. Alle 30 varianter af bakterien viste sig at være toksiske overfor æggene. Den toksiske aktivitet af d-endotoksin berigede fraktioner varierede fra en LD₅₀ på 0.025 til 2100 ng total protein per ml, dvs en variationsfaktor på 84000. To af de kommercielt anvendte B. thuringiensis varieteter, israelensis og kurstaki havde LD₅₀ værdier på henholdsvis 1.27 og 62 ng totalprotein per ml. Yderligere undersøgelser med B. thuringiensis var. israelensis toksinpreparationer og æg fra seks zooparasitiske og en fritlevende nematod(er) viste toksisitet over for alle syv arter af nematoder med LD₅₀ værdier i området 0.38-10.6 ng totalprotein per ml. B. thuringiensis letale effekt på nematoders æg er for T. colubriformis forårsaget af en ændring af strukturen af æggeskallen, hvilket medfører en ændret permeabilitet (Bone et al., 1987, Wharton og Bone, 1989). Bone et al. (1986) fandt ved bioassays med T. colubriformis og forskellige fraktioner af B. thuringiensis var. israelensis kulturer, at effekten på nematoders æg kan henføres til proteinkrystallen, som ikke kun indeholder insektspecifikke endotoksiner. Det blev også vist at toksisiteten kan henføres til et protein, da aktiviteten blev reduceret af proteolytiske enzymer. Yderligere fandt man, at den relevante fraktion ikke udviste effekt over for myggen Aedes aegypti, hvilket er et indicie for, at det ikke er de Diptera aktive toksiner, som udviser effekt på nematoders æg. På samme måde havde oprensede B. thuringiensis var. israelensis Diptera aktive proteiner ingen effekt over for nematoderne.

b-exotoksin

Visse B. thuringiensis typer, som f.eks. varieteten thuringiensis producerer b-exotoxin, som kan udskilles i dyrkningsmediet. Dette toxin er en RNA syntese inhibitor (Bone, 1989). b-exotoksin produceres ikke af hovedparten af de kommercielt anvendte stammer, som f. eks B. thuringiensis var. israelensis (Lisansky et al., 1993). Toksinet inhiberer æg-klækning og drab af andet trin larver af den plantepatogene nematod Meloidogyne spp. (Prasad et al., 1972). Ligeledes var b-exotoksin årsag til, at væksten i kulturer af den fritlevende nematode Panagrellus redivivus blev signifikant hæmmet, at den tomat patogene Meloidogyne incognita ikke dannede galler på tomatrødder, og at den mycophage Aphelenchus avenae blev hæmmet markant i vækst (Ignoffo og Dropkin, 1977). Det kommercielle produkt Thuringiensin, som indeholder b-exotoksin, var i stand til at reducere antallet af N. brasiliensis i tarmsystemet hos mus (Bone, 1989).

Effekt på larver og voksne

Det er imidlertid ikke kun B-exotoksin, som kan hæmme larver og voksne nematoder. Meadows et al. (1990) fandt således, at oprensede d-endotoksiner fra B. thuringiensis varieteterne israelensis, kurstaki, og morrisoni var i stand til effektivt at reducere den fritlevende nematod Turbatrix aceti i antal. Varieteten israelensis effekt på såvel larver som voksne nematoder var mere udtalt end kurstaki's; dette svarer til effekterne overfor æg, som er beskrevet tidligere.

Spore spiring

I ovenstående undersøgelser er der arbejdet med mere eller mindre oprensede toksiner. I nogle tilfælde er der anvendt såkaldt toksinberigede fraktioner, hvor sporerne er søgt fjernet ved gradient centrifugeringer. I disse tilfælde kan det ikke udelukkes, at effekterne på nematoderne er forårsaget af en kombination af toksiner og spirede B. thuringiensis celler. I forbindelse med en screening af B. thuringiensis isolater for aktivitet overfor nematoder fandt Borgonie et al. (1995) således spirende sporer i forbindelse med alle 12 arter af nematoder, uanset om spore-krystal blandingen var toksisk for nematoderne eller ej. Hyppigheden af sporespiring var nematodarts afhængig. I en anden rapport (Leyns et al., 1995), testedes aktiviteten af 128 forskellige B. thuringiensis spore-krystal preparationer over for juvenile og voksne Caenorhabditis elegans (en fritlevende nematod). Af de 128 B. thuringiensis isolater viste 109 stort set ingen effekt overfor nematoder, 16 isolater udviste en mortalitet på mellem 10 og 20%, mens tre isolater resulterede i mortaliteter på henholdsvis 21, 47 og 59%. I denne forsøgsrække blev der ikke observeret letale effekter over for nematoders æg. Dette skyldes sandsynligvis, at sporespiring og vækst var inhiberet i forsøgene, idet der var tilsat et antibiotikum. Det er derfor meget sandsynligt, at visse varianter af B. thuringiensis effekt overfor nematoders æg er knyttet til bakteriens spiring og vækst. I overensstemmelse hermed har vi observeret (se bilag 2), at alle afprøvede B. thuringiensis isolater var letale over for voksne Panagrellus redivivus når der ikke var tilsat et antibiotikum, mens kun få bakterier var letale når der var tilsat et antibiotikum.

Specifik aktivitet

Flere af de bakterier, som vi har anvendt i testen over for P. redivivus, er tidligere blevet patenteret som B. thuringiensis stammer med en specifik aktivitet overfor nematoder (Edwards et al., 1990). Yderligere en række bakterier og gener med nematicidal aktivitet er søgt patenteret (Narva et al., 1991). Analyserne, som ligger til basis for patentet (Edwards et al., 1990), er blevet foretaget med sporekrystal blandinger, hvor sporene er blevet inaktivteret ved ⁶⁰Co bestråling. Det fremgår ikke tydeligt af patentet, men vi skønner, at B. thuringiensis dødesporerkrystal blandingen må have en tæthed på 10⁸10¹⁰/krystaller per ml for at kunne inaktivere alle nematoderne ved in vitro bioassays. Det er således vist, at der findes specielle varieteter af B. thuringiensis, som udviser en aktivitet overfor nematoder, der er knyttet til specifikke toksiner, hvor man har kendskab til generne som koder for toksinerne. Det er blevet sandsynliggjort, at B. thuringiensis varieteter med gener kodende for disse toksiner er almindeligt forekommende i jord (Hansen et al., 1996).

Krystal proteiner

Ved bioassays, med krystalberigede fraktioner, hvor eventuelle sporer er stråledræbte, anvendes omkring 150 nematoder og 100 mg protein, hvilket resulterer i en mortalitet på 99-100%. Selv om voluminer ikke er angivet, skønnes det på baggrund af metodebeskrivelserne i andre rapporter vedrørende B. thuringiensis-nematode bioassays, at proteinkoncentrationen er ca. 1 mg per ml. Disse proteinmænger er i størrelsesordenen 10⁶ gange større end de LD₅₀ værdier som Bottjer et al. (1985) fandt. Dette er endnu et indicium for, at af sporespiring og vækst har betydning for B. thuringiensis effekter på nematoder. Leyns et al. (1995) fandt også, at relativt høje doser er nødvendige for at se effekt på nematoder. Der var ingen effekt med en sporedensitet på 10⁷ per ml, og først ved densiteter på over 10⁸ var der signifikante effekter på nematoderne. Ved disse forsøg blev der, som tidligere nævnt, anvendt antibiotika. I vore egne bioassays blev der også anvendt antibiotika for at forhindre bakterievækst (bilag 2).

In vitro – in vivo

Det skal understreges, at hovedparten af data, der er refereret hidtil i dette afsnit, er baseret på in vitro undersøgelser. Bone (1989) fandt, at et kommercielt produkt baseret på B. thuringiensis var. israelensis havde lavere nematicidal aktivitet in vivo i mus inficeret med N. brasiliensis end in vitro. Det omvendte forhold gjorde sig gældende for et produkt, hvor toxiciteten var baseret på d-exotoksin.

Sprøjte dosis

I forbindelse med dosisaktivitets forhold er det relevant at nævne, at umiddelbart efter kommerciel flysprøjtning af et skovområde i Québec med B. thuringiensis var. kurstaki fandt man 7×10⁵ CFU per cm² skovbund (Cardinal and Marotte, 1987). Ved vore feltforsøg med samme bakterie-type indeholdt sprøjtevæsken 6.5×10⁷ CFU per ml, og de højeste antal genfundne bakterier på blade og i jord lige efter sprøjtning var henholdsvis 10⁷ og 10⁴ per gram (Pedersen et al., 1995).

Reel dosis

Det skal her understreges, at selv om en sporedensitet på 10⁷ per ml ikke har nogen effekt in vitro er det ikke ensbetydende med, at en langt lavere sporedensitet pr. gram jord nødvendigvis ikke har aktivitet. Dette skyldes, at vi ikke har et kendskab til sporer og krystallers fordeling i jorden. Hvis f.eks B. thuringiensis primært findes i jordens vandhinder, så vil der i en jord med lavt vandindhold sandsynligvis være høje densiteter af B. thuringiensis i de vandhinder, hvor bakterien findes. Som en konsekvens heraf vil effekten på nematoder in vivo kun kunne bestemmes eksperimentelt. Sådanne undersøgelser er ikke øjensynligt ikke blevet gennemført.

2.2.2 Nematoder og aktinomyceter

Vi har ikke fundet litteratur, der belyser interaktioner imellem aktinomyceter og nematoder, og dermed naturligvis heller ikke angående S. griseoviridis.