|
Afgivelse af organisk stof fra polymere materialer - mikrobiel vækst 4 EkstraktionsmetoderFørste trin i at fastlægge en ekstraktionsmetode var at afgøre om ekstraktionen af materialet skulle forløbe med eller uden tilstedeværelsen af testbakterierne. En mulighed var at ekstraheres materialet uden tilstedeværelse af testbakterier, med en efterfølgende ordinær AOC-bestemmelse på ekstraktet. En anden mulighed, som i højere grad ville simulere forholdene i distributionsnet, ville være at ekstrahere materialet med testbakterierne tilstede, hvorved AOC-værdien bestemmes samtidigt med ekstraktionen. En tredje mulighed ville være at ekstrahere materialet sammen med en naturlig drikkevandspopulation, hvilket ville give en endnu bedre simulering af forholdene i et distributionsnet. Dette ville dog ikke resultere i en konkret AOC-værdi, men det maksimalt opnåede bakterieantal ville i stedet kunne anvendes som mål for eftervækstpotentialet. For at afgøre hvilken type ekstraktion af materialet der var mest hensigtsmæssig, blev følgende tre ekstraktionsmetoder afprøvet:
4.1 ForsøgsgangDe tre ekstraktionsmetoder blev afprøvet i serier opdelt i to faser på hver 20 døgn. Teststykker blev ekstraheret fra dag 0 til dag 20, hvor stoffer fra materialerne kunne afgives til vandfasen. Dag 20 blev teststykkerne taget op, hvorved der fra dag 20 til dag 40 kunne måles AOC på ekstrakterne uden teststykkernes tilstedeværelse. Teststykker blev ekstraheret ved 10° C, mens ekstrakterne blev inkuberet ved 15° C. Testvandet blev i dette forsøg tilsat 10 m g KH2PO4-P/L inden brug for at hindre, at væksten skulle blive begrænset som følge af phosphormangel. I Figur 3 er angivet en principskitse af undersøgelsen af ekstraktionsmetoder. 4.1.1 Ekstraktion uden aktive bakterierForbehandlede teststykker med ballastmateriale (pasteuriseret i 30 minutter) blev ekstraheret i pasteuriseret testvand uden omrystning i mørke ved 10° C i 20 døgn. Dag 20 blev det ved en pladespredning kontrolleret, at der ikke var aktive bakterier tilstede i vandfasen. Derefter blev testmaterialet taget op, og ekstrakterne blev podet med P17 og NOX til AOC-bestemmelse. Ekstrakterne blev inkuberet i mørke ved 15° C i yderligere 20 døgn, hvor kimtallet blev bestemt på R2A-agar dag 20, 25, 27, 30, 35, 40. 4.1.2 Ekstraktion med P17 og NOXForbehandlede teststykker med ballastmateriale (pasteuriseret i 30 minutter) blev ekstraheret i pasteuriseret testvand, der dag 0 blev podet med P17 og NOX, så ekstraktionen forløb samtidig med væksten af P17 og NOX. Den kombinerede ekstraktion og AOC-bestemmelse forløb uden omrystning i mørke ved 10° C i 20 døgn, hvor kimtallet blev bestemt på R2A-agar dag 0, 5, 7, 10, 15, 20. 4.1.3 Ekstraktion med en naturlig populationForbehandlede teststykker med ballastmateriale (pasteuriseret i 30 minutter) blev ekstraheret i pasteuriseret testvand, der dag 0 blev podet med testvand i forholdet 9:1 (180 mL pasteuriseret testvand og 20 mL testvand). Ekstraktionen forløb efterfølgende ved 10° C i 20 døgn, hvorunder kimtallet for den naturlige population bestemt på R2A-agar (14 døgn ved 25° C) dag 0, 5, 7, 10, 15, 20. Dag 20 blev testmaterialet taget op. For at undersøge om der var tilgængeligt AOC tilstede efter denne inkubering, blev ekstrakterne pasteuriseret som ved en vanlig AOC-bestemmelse, podet med P17 og NOX og derefter inkuberet i mørke ved 15° C i endnu 20 døgn, hvor kimtallet blev bestemt på R2A-agar dag 20, 25, 27, 30, 35, 40.
Figur 3: Ekstraktionsmetoderne blev undersøgt med to materiale-typer: hvidt PEX-rør og blåt PEM(1)-rør. I hvert PEX-rørstykke blev en glaskugle (renset på samme måde som testflaskerne) sat i spænd i den ene ende som ballastmateriale, men enkelte af rørstykkerne blev så påvirket af pasteuristeringen, at spændet på glaskuglerne ikke kunne holdes. Dette blev dog skønnet ikke at have den store indflydelse på forsøget, da mindre end 2% af de pågældende rørs totale overflade ikke var vanddækket. Til PEM-rørstykkerne blev der anvendt net af rustfrit stål som ballastmateriale. 4.2 ResultaterBakteriekoncentrationer og AOC-værdier er angivet i Bilag H. 4.2.1 Ekstraktion uden aktive bakterierI ekstrakterne af PEX og blåt PEM(1) fremstillet uden aktive bakterier nåede vækstkurverne for P17 og NOX et maksimum, hvorefter de stagnerede eller faldt inden for 20 døgn (Figur 4 og Figur 5). Koncentrationerne af P17 var højere i ekstrakterne end i blindprøverne, mens der ikke var den store forskel på koncentrationerne af NOX imellem ekstrakter og blindprøver.
Figur 4: Ved beregning af gennemsnitlige AOC-værdier (Tabel 5) var AOCTotal for begge materialer 19 m g acetat-C/L, men for PEM materialet var AOCNOX lavere i ekstrakterne end i de tilhørende blindprøver. Dette kan forklares ved den kraftige vækst af P17 i ekstrakterne. De mange P17 har omsat stofferne, som P17 og NOX konkurrerer om, og har derved ikke levnet substrat til de færre NOX. Dette har ikke været tilfælde med blindprøverne, hvor P17 og NOX har haft mere ligeværdige konkurrenceforhold.
Figur 5: Tabel 5:
4.2.2 Ekstraktion med P17 og NOXI ekstrakter af PEX og blå PEM(1) fremstillet med samtidig AOC-bestemmelse stagnerede eller faldt vækstkurverne for P17 og NOX ikke inden for den 20 døgns periode (Figur 6 og Figur 7). Der blev opnået en smule højere P17 koncentrationer i ekstrakterne end i blindprøverne, hvilket ikke gjorde sig gældende for NOX koncentrationerne.
Figur 6: Tabel 6:
Figur 7: 4.2.3 Ekstraktion med en naturlig populationI ekstrakter fremstillet under tilstedeværelse af en naturlig population formede vækstkurverne for naturlige population sig anderledes end for P17 og NOX, idet den naturlige population voksede gennem hele 20 døgnsperioden (Figur 8). Dette kan skyldes, at startkoncentrationerne af den naturlige population var langt lavere (<15 CFU/mL) end startkoncentrationerne af P17 og NOX (200-500 CFU/mL). På trods af at en maksimal bakteriekoncentration formentlig ikke blev opnået, kunne der dag 20 registreres forskel på ekstrakter og blindprøver (Tabel 7). Der var lidt højere bakteriekoncentrationer i ekstrakterne end i blindprøverne, hvorved afgivelser fra de testede materialer understøttede væksten af den naturlige population. Tabel 7:
Figur 8: Da vækstkurverne for den naturlige population ikke stagnerede eller faldt gennem 20 døgn, var alt tilgængeligt substrat formodentligt ikke blevet omsat. Dette blev bekræftet ved den efterfølgende AOC-bestemmelse. Denne blev foretaget dag 20, efter at teststykkerne var taget op og alle ekstrakterne var pasteuriseret på ny. Der var tilgængeligt substrat nok tilbage i vandfasen til, at både P17 og NOX kunne øge deres bakteriekoncentrationer. Vækstkurverne for P17 og NOX i de pasteuriserede ekstrakter (Figur 9 og Figur 10) havde samme forløb, som vækstkurverne i ekstrakterne fremstillet uden aktive bakterier (Figur 4 og Figur 5). Ligeledes var koncentrationen af P17 højere i ekstrakterne end i blindprøverne. Bakteriekoncentrationerne af både P17 og NOX lå på et lavere niveau i samtlige pasteuriserede ekstrakter, end i ekstrakter fremstillet uden aktive bakterier, hvilke indikerede, at den naturlige population havde kunne omsætte et bredt spektrum af de organiske forbindelser. Ved beregning af maksimale gennemsnitlig AOC-værdier (Tabel 8) var der efter den naturlige populations vækst et bidrag fra materialet tilbage på 3 m g acetat-C/L for PEX og 18m g acetat-C/L for blåt PEM(1). For ekstrakter fremstillet uden aktive bakterier blev der for begge materialer opnået 19 m g acetat-C/L (Tabel 5). Den naturlige population kunne således i langt højere grad omsætte stoffer frigivet fra PEX materialet end fra det blå PEM(1) materiale.
Figur 9: Tabel 8:
Figur 10: 4.2.4 DiskussionAOC-værdier opnået ved samtidig ekstraktion og AOC-bestemmelse var lavere end AOC-værdier i ekstrakter fremstillet uden aktive bakterier. Foruden den allerede omtalte temperatureffekt på bakteriernes væksthastighed er der et andet forhold, der kan have haft betydning. AOC-metoden er designet ud fra, at bakterierne har adgang til den totale mængde substrat fra start (AOC-bestemmelse på ekstrakt). Tilføres substratet i stedet over tid (samtidig ekstraktion og AOC-bestemmelse), vil bakterierne vokse i takt med at substratet tilføres, hvilket giver et andet vækstforløb. Dette kunne der korrigeres for ved at fastlægge udbyttekonstanterne på samme måde. En sådan løsning vil dog være kompliceret at gennemføre i praksis, og da hastigheden, hvormed substratet afgives, sandsynligvis varierer imellem forskellig materialer; vil dette ikke være en brugbar løsning. I henhold til migrationsstandarden /DS/EN 852-1, 1997/ testes varmtvandsinstallationer ved 60° C. Ved denne temperatur vil det ikke være muligt at udføre ekstraktionerne sammen med aktive bakterier (medmindre der vælges termofile stammer). Fremstilles der vandige ekstrakter, kan testtemperatur derimod vælges vilkårligt, idet ekstraktet kan fremstilles ved den ønskede temperatur, hvorefter AOC-bestemmelsen udføres ved 15° C. Dette giver samtidig mulighed for at ekstrahere materialer under andre forhold, hvor bakterier ikke kan vokse f.eks. ved høje klorkoncentrationer eller ved høj eller lav pH. Ekstraktionen udføres under de ønskede forhold, og efter afkklorering af vandet eller indstilling af pH kan AOC-bestemmelsen udføres med testbakterierne. P17 kan omsætte aminosyrer, letomsættelige carboxylsyrer, carbonhydrater, alkoholer og aromatiske forbindelser, mens NOX kan omsætte de svært-omsættelige carboxylsyrer såsom format, oxalat, glycollat og glyoxylat /van der Kooij et al., 1995/. De forbindelser man kan forvente afgivet fra polymere materialer, er således overvejende stoffer som P17 kan vokse på, hvilket stemmer overens med resultaterne fra undersøgelsen af ekstrationsmetoder. Materialernes eftervækstpotentiale kan dermed med rimelighed forventes fastlagt som forskellen i AOCP17 imellem ekstrakter og blindprøver. Dette betyder, at undersøgelserne vil kunne udføres med P17 som eneste testbakterie, hvilket vil medføre nedenstående fordele:
Ved ekstraktion af materialerne sammen med en naturlig population blev vandet fra Lyngby vandværk inden anvendelse fortyndet med pasteuriseret testvand for at opnå en tilpas lav startkoncentration af bakterier. Ved at anvende en relativ lav startkoncentration af bakterier var det forventet, at der tydeligere kunne ses en effekt af afgivelserne fra materialerne. En tælling på vand fra Lyngby vandværk foretaget på et senere tidspunkt viste imidlertid, at dette vand har en naturlig bakteriekoncentration på omkring 200 CFU/mL. Den foretagne fortynding dag 0 har antageligvis således resulteret i en startkoncentration af den naturlige bakteriepopulation på ca. 20 CFU/mL, hvilket var langt lavere end forventet. For at opnå en startkoncentration af den naturlige bakteriepopulation på samme niveau som P17 og NOX (200-500 CFU/mL), skulle testvand udtaget på Lyngby vandværk havde været anvendt uden forudgående fortynding. Den uhensigtsmæssige lave startkoncentration af den naturlige population kan tildels være skyld i, at der ikke blev opnåede maksimale værdier inden for den 20 døgns periode. Den lave startkoncentration resulterede i en lav initial væksthastighed, hvilket betød at lange inkuberingstider ville havde været påkrævet for at opnå maksimale værdier. Den lave startkoncentration kan endvidere have influeret på hvilke bakterietyper, der voksede op og dominerede. Hurtigtvoksende stammer ville i langt højere grad have kunne udkonkurrere langsomtvoksende, end hvis der havde været en større initial koncentration. Desuden kunne der have manglet bakterier specielt gode til at vokse på de stoffer, der blev afgivet fra materialerne. Ekstrakterne fremstillet med en naturlig population tilstede blev pasteuriseret inden den efterfølgende AOC-bestemmelse. Ved at sammenligne de opnåede AOC-værdier med de tilsvarende værdier opnået i ekstrakterne fremstillet uden aktive bakterier, kan det konstanteres, at pasteurisering af en vandprøve ikke frigiver en betydelig mængde AOC fra de døde celler. En vandprøves naturlige indhold af bakterier har således ikke nogen indflydelse på den AOC-værdi, der måles i prøven. I tre af CEN-metoderne gennemgået i kapitel 2 er én af parametrene til fastlæggelse af eftervækstpotentialet mængden af fasthæftet bakterier på overfladerne. Teststykkerne af PEX og Blå PEM(1) fra ekstraktionen sammen med P17 og NOX og fra ekstraktionen sammen med en naturlig population blev efter endt ekstraktion undersøgt for fasthæftede bakterier /Corfitzen, 1999/. De fundne bakterieniveauer var af en så lille størrelsesorden, at de kunne tilskrives, at der sad en vandfilm tilbage på teststykkerne efter optagning. En kontaktperiode på 20 døgn ved 10° C var således ikke tilstrækkelig til, at et betydende antal bakterier hæftede på materialeoverfladerne. Fasthæftede bakterier var således ikke årsag til forskelle imellem ekstraktionsmetoder, og afgivelsen fra materialerne kan reelt fastlægges ved måling på vandfasen. Grunden til at der ikke blev dannet biofilm på materialeoverfladerne var sandsynligvis den korte ekstraktionstid. For f.eks. KIWA metoden vil der ikke kunne måles biofilm på materialet før 100-200 døgn efter podning. Sammenholdt med de phosphor-koncentrationer, der generelt er i dansk drikkevand, ville de observerede bakterieantal næppe give anledning til phosphor-mangel (idet bakterierne generelt behøver C, N og P i forholdet 100:10:1). Det blev derfor besluttet ikke at tilsætte phosphor til testvandet. Kontamineringsrisikoen forbundet med tilsætningen af phosphor ville da blive elimineret. På baggrund af de opnåede resultater fra undersøgelserne med PEX og blåt PEM(1) er det hensigtsmæssigt at fastlægge polymere materialers eftervækstpotentiale som AOC-værdien i et vandigt ekstrakt af materialet fremstillet uden aktive bakterier. Dette giver mulighed for at anvende vilkårlige testforhold og forenkler tolkningen af bakteriekoncentrationer. AOC-bestemmelsen kan med fordel udføres med P17 alene, da NOX tilsyneladende ikke kan udnytte de stoffer, som bliver afgivet fra de undersøgte polymere materialer. Skal eftervækstpotentialet bestemmes ved brug af en naturlig population, skal koncentrationen af aktive bakterier i vandet ikke fortyndes før brug.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
