| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Hormonforstyrrende effekter af kombinationer af pesticider

3 Hormonforstyrrende effekter af en kombination af almindeligt anvendte pesticider

• 3.1 Østrogen effekt af kombinationer af 5 pesticider in vitro
• 3.2 Antiandrogen effekt af kombinationer af 5 pesticider in vitro
• 3.3 Antiandrogen effekt af kombinationer af 5 pesticider in vivo
• 3.4 Effekt af kombinationer af 5 pesticider efter in utero eksponering af hanrotter
  • 3.4.1 Formål med studiet
  • 3.4.2 Design af studiet
  • 3.4.3 Undersøgelse af mødre og afkom for føtotoksiske og hormon-afhængige effekter
  • 3.4.4 Effekt på hormonniveauer
  • 3.4.5 Effekt på organer
  • 3.4.6 Effekt på adfærd og sædkvalitet
• 3.5 Konklusion på hormonforstyrrende effekter af 5 pesticider

3.1 Østrogen effekt af kombinationer af 5 pesticider in vitro

Som eksempler på almindeligt anvendte pesticider i Danmark blev valgt:

• Karbamat-insekticidet methiocarb, der har vist svagt østrogene og antiandrogene effekter in vitro (Andersen et al., 2002)
• Herbicidet tribenuron-methyl er fundet at være svagt østrogent in vitro (Andersen et al., 2002)
• Pyrethroid-insekticidet deltamethrin er også fundet at være svagt østrogent in vitro (Andersen et al., 2002)
• Fungicidet prochloraz der har antiøstrogene og antiandrogene effekter in vitro (Andersen et al., 2002)
• Herbicidet simazin, der af andre er beskrevet som en aromatase inducer in vitro (Sanderson et al., 1999).

Den østrogene effekt in vitro af de 5 pesticider blev testet i MCF-7 celle proliferationsassayet som beskrevet i afsnit 2.1. Pesticiderne blev testet enkeltvis og i en ækvimolær (1:1:1:1:1) blanding i koncentrationer op til 25 μM. Pesticiderne blev testet både uden og med 10 pM 17β-østradiol for at undersøge såvel agonistisk som antagonistisk effekt (Figur 3.1.1 og 3.1.2).

Ved testning af pesticiderne uden 17β-østradiol var det kun methiocarb og deltamethrin, som inducerede et østrogent respons. Tribenuron-methyl, som i en tidligere undersøgelse var svagt østrogent ved 25 og 50 μM (Andersen et al., 2002), gav ikke noget respons i denne undersøgelse. Som det ses af Figur 3.1.1 gav blandigen ikke noget synligt respons indenfor de undersøgte koncentrationer. Ud fra de fittede kurver er isobolkoefficient ved EC₅ beregnet:

Da isobolkoeficcienten er > 1 tyder det på en antagonistisk effekt i blandingen. Den antagonistiske effekt skyldes sandsynligvis prochloraz, som udviser en tydelig hæmning af 17β-østradiol-induceret MCF-7 celleproliferation (Figur 3.1.2). Prochloraz udviser ingen østrogen aktivitet når det testes uden østradiol. Methiocarb, som udviste østrogen effect når det blev testet alene, havde også en svag antiøstrogen virkning overfor 17β-østradiol. Da blandingen ikke havde nogen effekt på det østradiol-inducerede respons, var det ikke muligt at udregne en isobolkoefficient for blandingen. På figuren ses det dog, at den forventede antagonistiske virkning er større end den observerede, hvilket indikerer, at den antiøstrogene virkning af prochloraz modvirkes af de østrogene pesticider.

Klik her for at se figuren.

Figur 3.1.1. Koncentrations-responskurver for MCF-7 celle proliferation for de fem pesticider enkeltvis og i en 1:1:1:1:1 blanding. Data er angivet som middel ±SD for 3-5 uafhængige forsøg, undtagen for tribenuroin-methyl hvor n=1.

Klik her for at se figuren.

Figur 3.1.2. Koncentrations-responskurver for MCF-7 celle proliferation for de fem pesticider enkeltvis og i en 1:1:1:1:1 blanding testet sammen med 10 pM 17β-østradiol. Data er angivet som middel ±SD for 3-5 uafhængige forsøg.

3.2 Antiandrogen effekt af kombinationer af 5 pesticider in vitro

De 5 pesticiders effekt på AR blokering in vitro blev testet i det beskrevne reportergen assay (afs. 2.4). Samtidig blev cytotoksiciteten af stofferne testet ved co-transfektion af cellerne med reportergen vektoren MMTV-LUC og AR13, der er en vektor der koder for en konstitutivt udtrykt AR, men som mangler det ligand-bindende domæne. En cytotoksisk effekt på transkriptionsprocessen vil give sig udslag i et fald i luciferaseaktiviteten. Prochloraz havde cytotoksisk effekt ved 50 μM og derover og deltamethrin var cytotoksisk ved koncentrationer på 12.5 μM og derover, mens de resterende pesticider ikke var cytotoksiske ved koncentrationer ≤50 μM.

Hverken tribenuron-methyl eller simazin havde nogen antiandrogen effekt i dette assay, mens både prochloraz og methiocarb blokerede AR med IC₅₀ værdier på hhv. 7 og 15 μM (Fig 3.2.1). Da deltamethrin var cytotoksisk ved koncentrationer højere end 12.5 μM, var det ikke muligt at bestemme en IC₅₀ værdi.

Kombinationen af en 1:1:1:1:1 blanding af de 5 pesticider gav et antiandrogent respons, der lå på linie med det prædikterede respons under antagelse af additivitet (Fig 3.2.2).

Klik her for at se figuren.

Figur 3.2.1. Koncentrations-respons kurver for androgenreceptor inhibering in vitro for de fem pesticider hver for sig og for en 1:1:1:1:1 blanding af pesticiderne. Data er angivet som middel ±SD for 3 uafhængige forsøg

Figur 3.2.2 Sammenligning af pesticidblandingens (1:1:1:1:1) prædikterede og observerede hæmning af AR-aktivering in vitro.50 μM svarer til 10 μM af hvert pesticid i blandingen. Data er angivet som middel ±SD for 3 uafhængige forsøg.

Databehandling v.hj.a. isobolmetoden blev udført ved forskellige valgte effektniveauer og som eksempel er vist udregningen af isobolkoefficienten ved effektniveau IC₂₅, som resulterede i en koefficient på 0.94. Ved en koefficient på 1 er der additivitet, er den < 1 er der synergisme og > 1 antagonisme, så resultatet indikerer, at stofferne i kombination virker additivt i dette assay.

Eksempel på beregning af isobolkoefficient ved effektniveau IC₂₅:

Klik her for at se figuren.

3.3 Antiandrogen effekt af kombinationer af 5 pesticider in vivo

De samme 5 pesticider som blev testet for antiandrogen effekt in vitro, blev testet in vivo i et udbygget Hershberger assay, hvor effekter på både organvægte, hormonniveauer og genekspression blev analyseret. I første omgang var ideen udelukkende at screene en blanding af de 5 stoffer for at afsløre om der var effekt eller ej. Det blev senere besluttet at inkludere 5 grupper dyr, som fik indgivet enkeltstofferne alene. På basis af et sådant forsøg er det udelukkende muligt at få en indikation af om der er en kombinationseffekt. Da der ikke er udført dosis-respons forsøg, kan en eventuel mekanisme for interaktion ikke udledes.

54 Wistar hanrotter blev kastrerede ca. 4 uger gamle og ankom en uge før dosering, ca. 5 uger gamle. De blev randomiseret efter vægt, således at der ikke var statistisk signifikant forskel på middellegemsvægt mellem grupperne. Dyrene blev fodret med Syn 8.IT, en diæt fri for fytoøstrogener, og fik adgang til syrnet vand, begge dele ad libitum. Stalden havde en rumtemperatur på 22 ±1°C og en luftfugtighed på 55± 5 %. Der var luftskifte 10 gange i timen, mens der blev holdt en tolv-timers lys/mørke cyklus fra 9-21 og 21-9. Rotterne blev tilset for helbredseffekter og vejet to gange dagligt under doseringsperioden, som fandt sted i syv dage, en uge efter ankomst.

Gruppe 1 blev doseret dagligt med jordnøddeolie, som var mediet teststofferne var opløst i. De resterende 8 grupper blev doseret med 0.5 mg/kg testosteronpropionat plus/minus teststof. Gruppe 2 fik kun testosteronpropionat og fungerede som kontrolgruppe. Flutamid, som er et kendt antiandrogen der anvendes klinisk, fungerede som positiv kontrol i gruppe 3 med en dosering på 20 mg/kg s.c. Gruppe 4-8 blev doseret enkeltvis med teststofferne: prochloraz, simazin, deltamethrin, tribenuron-methyl og methiocarb med en dosis på henholdsvis 25, 25, 2.5, 25 og 2.5 mg/kg. En kombination af teststofferne svarende til 80 mg/kg (25+25+2.5+25+2.5 mg/kg) blev administreret til gruppe 9. Testosteronpropionat og flutamid blev givet s.c. med et doseringsvolumen på 2 ml/kg, mens teststofferne blev givet oralt med sonde i et volumen på 5 ml/kg. Testosteron blev indgivet 2-10 min. efter teststofferne og den sidste dosering skete om morgenen den dag sektion af dyrene skulle foregå.

Under bedøvelse med CO₂/O₂ blev blodet fra dyrene tappet ved hjertepunktur og serum fremstillet og nedfrosset ved –80°C til senere analyse for LH, testosteron, thyroxin og prolaktin. Lever, nyrer og binyrer blev udtaget, renset og vejet, det samme skete for thyroidea, bulbourethralkirtler, sædblærer, ventral prostata samt Musc.levator ani/bulbocavernosus. Efter vejning blev ventral prostata hurtigt placeret i 0.5 ml RNAlater (Ambion, Huntingdon, England), sat på –20°C frys indtil oprensning af RNA, cDNA-produktion og efterfølgende genekspressionsanalyser.

Et forforsøg til testning af optimal dosis af deltamethrin (25 mg/kg) og methiocarb (2.5 mg/kg) blev foretaget på gamle ikke-kastrerede Wistar hanrotter med det formål at undersøge, hvorvidt rotterne kunne tåle dosis. Pga. tydelig toxicitet af 25 mg/kg deltamethrin blev yderligere et forforsøg med 5 mg/kg deltamethrin foretaget. Ud fra disse forsøg blev en dosis på 2.5 mg/kg valgt for begge dyregrupper.

De endelige legems- og organvægte er angivet i Tabel 3.3.1. Generelt sås ingen effekt af enkeltstofferne på hverken lever-, nyre-, binyre- eller thyroideavægte, bortset fra at prochloraz gav forøget levervægt. Derudover var binyrevægten forøget efter dosering med blandingen.

Tabel 3.3.1. Legems- og organvægte

N=6; *: p< 0,05.

Med hensyn til effekt på vægte af reproduktionsorganer sås at den positive kontrol, flutamid, som ventet havde signifikant effekt på vægte af både ventral prostata, sædblære, m.levator ani/bulbocavernosus og bulbourethralkirtlen (Tabel 3.3.2). Der sås ingen effekt af enkeltstofferne, men kombinationsgruppen viste et signifikant fald i vægte af m.levator ani/bulbocavernosus og bulbourethralkirtlen. Der var også en tendens til en reduktion af prostata- og sædblærevægte, men disse slog ikke signifikant ud. Resultaterne indikerer en akkumulerende effekt af pesticiderne, som ikke kan påvises når de administreres enkeltvis til dyrene, men kun når de indgives i kombination.

Tabel 3.3.2. Absolutte vægte af reproduktionsorganer

*Statistisk signifikant forskellig (p < 0,05) fra testosterongruppen. N=6.

'T' eller 'Testo': testosteronpropionat 0.5 mg/kg/dag s.c.; 'Flut': flutamid 20 mg/kg/dag s.c.; 'Pro': prochloraz 25 mg/kg/dag oralt; 'Sima': simazin 25 mg/kg/dag oralt; 'Delt': deltamethrin 2.5 mg/kg/dag oralt; 'Trib': tribenuron-methyl 25 mg/kg/dag oralt; 'Meth': methiocarb 2.5 mg/kg/dag oralt; 'Kombi': prochloraz (25 mg/kg/dag) + simazin (25 mg/kg/dag) + deltamethrin (2.5 mg/kg/dag) + tribenuronmethyl (25 mg/kg/dag) + methiocarb (2.5 mg/kg/dag).

Resultaterne af hormonanalyserne fremgår af nedenstående tabel og viser, at flutamid giver et signifikant forhøjet LH niveau, mens de andre hormonniveauer er upåvirkede. Ingen af pesticiderne doseret enten enkeltvis eller i kombination påvirkede de fire hormoner. Dog gav tribenuron-methyl et signifikant fald i prolaktinniveauet.

Tabel 3.3.3. Hormonniveauer målt i serum fra kastrerede Wistar rotter behandlet med testosteronpropionat alene eller sammen med teststof

*Statistisk signifikant forskellig (p < 0,05) fra testosterongruppen

n.d.: not detectable. Se i øvrigt tabeltekst til tabel 3.3.2.

Effekten af flutamid og pesticiderne på genekspressionsniveau i prostata blev undersøgt. Som ventet gav flutamid et signifikant fald i PBP C3 og ODC mRNA niveau, mens niveauet af TRPM-2 mRNA var signifikant forhøjet (Fig 3.3.1). Disse resultater er i overenstemmelse med tidligere fund (Nellemann et al. 2003). Prochloraz gav en signifikant reduktion af PBP C3 og ODC mRNA niveauet, men havde ingen effekt på TRPM-2 mRNA. Denne effekt har vi tidligere rapporteret for stoffet givet i en dosis på 50 mg/kg (Vinggaard et al. 2002) og nu kan vi konkludere, at effekten også ses efter en dosis på 25 mg/kg. Samtlige pesticider enkeltvis og i kombination gav et signifikant fald i ODC mRNA niveauet og ligeledes sås der et fald i PBP C3 mRNA for alle pesticider undtagen deltamethrin, tribenuron-methyl og kombinationsgruppen. Det er et enkelt dyr som er årsag til at kombinationsgruppen ikke slår ud. Da der er vist antiandrogene effekter in vitro for både prochloraz og methiocarb kan dette forklare faldet i det androgen-regulerede gen PBP C3. Det er overraskende at pesticidet simazin også påvirker PBP C3 mRNA, da det ikke binder direkte til androgen receptoren. Effekten kan muligvis forklares udfra den aromatase-inducerende effekt af simazin, der er påvist in vitro. En øget aromataseaktivitet vil resultere i en øget omsætning af testosteron til østradiol, hvilket kunne tænkes at sænke testosteronniveauet i dyrene og dermed indirekte forårsage den antiandrogene effekt. Men da der ikke kan påvises reduceret testosteronniveau i serum (Tabel 3.3.3) virker denne forklaring ikke umiddelbart plausibel. Vi må konstatere, at der på genniveau sker en række ændringer, som ikke er direkte relaterede til ændringer i organvægte eller hormonniveauer, og som vi ikke umiddelbart kan forklare.

Klik her for at se figuren.

Figur 3.3.1. Effekt af de fem pesticider hver for sig og i en blanding på PBP C3, ODC og TRPM-2 mRNA i ventral prostata. Data er angivet som middel ±SD for n=6. Dyr i alle grupper har fået testosteronpropionat med undtagelse af kontrolgruppen. 'Testo': testosteronpropionat 0.5 mg/kg/dag s.c.; 'Flut': flutamid 20 mg/kg/dag s.c.; 'Delt': deltamethrin 2.5 mg/kg/dag oralt; 'Meth': methiocarb 2.5 mg/kg/dag oralt;'Pro': prochloraz 25 mg/kg/dag oralt; 'Sima': simazin 25 mg/kg/dag oralt;'Trib': tribenuronmethyl 25 mg/kg/dag oralt;'Kombi': prochloraz (25 mg/kg/dag) + simazin (25 mg/kg/dag) + deltamethrin (2.5 mg/kg/dag) + tribenuronmethyl (25 mg/kg/dag) + methiocarb (2.5 mg/kg/dag).

3.4 Effekt af kombinationer af 5 pesticider efter in utero eksponering af hanrotter

3.4.1 Formål med studiet

Formålet med dette eksperiment var at undersøge, om en blanding af de 5 pesticider ville forårsage nogen føtotoksiske eller hormonforstyrrende effekter på rotteunger, der var blevet doseret in utero. Dosering af dyr under fostertilværelsen forventes, at ville forårsage de mest markante effekter pga. forøget følsomhed af dyrene i denne periode.

3.4.2 Design af studiet

Unge voksne hunrotter med en legemsvægt på ca. 200 g (Mol:WIST,SPF Møllegaard Breeding Center Ltd., Ejby, Danmark) blev parret indenfor 1 døgn og leveret på dag 3 af drægtigheden (GD3). Hunnerne blev tilfældigt fordelt parvis og blev opstaldet under standard betingelser og med kontrollerede miljøbetingelser. På ankomstdagen blev hunnerne vejet og fordelt i grupper med ligelig vægtfordeling. Indtil GD20 blev hunnerne opstaldet parvis og individuelt derefter. De blev observeret 2 gange dagligt for tegn på toxicitet. Legemsvægt blev registreret dagligt fra GD7 til postnatal dag (PND) 16. Fra GD21 blev dyrene inspiceret to gange dagligt og fødselstidspunkt registreret. Efter fødslen blev legemsvægt af mødre og unger registreret. Ungerne blev talt, kønsfordelt og checket for anomalier. Dagen for fødslen blev kaldt PND 0.

I første del af forsøget blev 3 grupper af 8 mødre doseret oralt med jornøddeolie, 30 mg/kg/dag prochloraz eller en blanding af de 5 pesticider i alt 20 mg/kg/dag fra GD 7 til GD21 i et doseringsvolumen på 2 ml/kg legemsvægt. De 20 mg/kg/dag bestod af 15 mg/kg/dag prochloraz og hver 1.25 mg/kg af de følgende pesticider deltamethrin, methiocarb, simazin og tribenuron-methyl. På GD21 blev fostrene udtaget ved kejsersnit. Oprindelig var det planlagt at give dyrene 40 mg/kg/dag af blandingen, men efter 4 doseringer af halvdelen af mødrene viste der sig synlige toksiske effekter på mødrene og derefter blev dosis halveret til 20 mg/kg/dag. Under den efterfølgende databehandling blev der for alle parametre undersøgt om der var forskel på effekterne for 1. sæt der var startet på høj dosis og 2. sæt der havde fået den endelige dosis hele vejen igennem og der sås ingen forskelle, hvorefter alle data blev puljet og behandlet under et.

I den anden del af studiet blev 3 grupper af 18 mødre doseret fra GD7 til PND 16 med de samme doser som i første del af studiet. På PND16 blev 1 han og 1 hun taget fra moderen og aflivet. Væv blev udtaget til hormonanalyser, genekspressionsanlyser og patologi. Èn han og én hun per kuld fortsatte i forsøget og der blev foretaget undersøgelse for kønsmodning, adfærd, hormonniveauer og sædkvalitet i de voksne hanner (PND220).

3.4.3 Undersøgelse af mødre og afkom for føtotoksiske og hormon-afhængige effekter

Som det fremgår af tabel 3.4.1 sås der med kombinationen af pesticider en statistisk signifikant reduktion af mødrenes vægt efter fødslen og deres tilvækst i doseringsperioden. Vægtreduktionen sås også hos både det hanlige og hunlige afkom og varede ved til ungerne blev voksne (Tabel 3.4.2). Derudover sås ingen føtotoksiske effekter af kombinationen og der var ingen effekt på hverken anogenital afstand eller alder for kønsmodning. Mht. effekten på brystvorter i hanner var der ingen signifikant effekt på det gennemsnitlige antal brystvorter i kuldene efter pesticid-dosering, men derimod var procentdelen af kuld med 0 brystvorter markant reduceret (fra 32% til 4 %).

I mødrene, der udelukkende var doseret med prochloraz, sås også en vægtreduktion fra GD7 til efter fødslen, mens vægten af mødrene efter fødslen og afkommet var upåvirket. Det viste sig, at prochloraz inducerede en forlængelse af drægtighedsperioden og gav markant flere brystvorter i hanner, mens anogenital afstand og alder for kønsmodning var upåvirkede.

Table 3.4.1 Drægtigheds- og kulddata

# (no. implantations-live pups at day 6)/no. implantations

* p < 5%; ** p < 1% compared to control group;

Table 3.4.2. Legemsvægt efter fravænning og kønsmodning

* p < 5%;
** p < 1% compared to control group

3.4.4 Effekt på hormonniveauer

Vi observerede det interessante, at både kombinationen og prochloraz forårsagede et statistisk signifikant fald i både testikulær og plasma testosteron i GD21 hanner. Samtidig hermed var den testikulære progesteronkoncentration signifikant højere for begge grupper. Der var ingen signifikant effekt på plasma LH, men der sås en tendens til stigning. Generelt er det vanskeligt at opnå signifikans på hormonniveauer i plasma fra kejsersnitdyr, da det er nødvendigt at pujle blod fra alle dyr i kuldet og også nogle gange flere kuld for at få nok plasma til analyserne.

Den markante effekt på testosteron- og progesteronniveauet var forsvundet i PND16 dyr.

Tabel 3.4.3. Hormonniveauer i hanligt afkom GD21, PND 16 og PND 220

a) To pools per hold

b) N= 16, 20 og 14 for de 3 hold

c) N= 5, 4 og 4 (pools for 3-4 dyr) for de 3 hold

d) N=16 for hvert af de 3 hold

e) N= 9, 10, 9 for de 3 hold

f) N= 18, 20, 14 for de 3 hold

*) p< 0,05

3.4.5 Effekt på organer

For at vurdere om pesticiderne havde effekt på organer blev organerne vejet samt vurderet makroskopisk og mikroskopisk.

Organvægte blev målt ved aflivning af PND16 han- og hunner samt på PND 220 hanner. På PND16 var legemsvægten signifikant reduceret i kombinationsholdet for både hanner og hunner (se tabel 3.4.4 og 3.4.5). Tillige var vægten af bulbourethralkirtlen signifikant reduceret hos både prochloraz- og kombinationsholdet (se tabel 3.4.4). Ændringen af vægten af bulbourethralkirtlen skyldes formentlig primært den antiandrogene effekt af prochloraz, da effekten ikke var større i kombinationsholdet.

Hos voksne hanner (PND220) var der ikke længere nogen forskel mellem holdene (se tabel 3.4.6).

Tabel 3.4.4 Legems-og organvægte for PND16 hanner

Data repræsenterer middel ± SD

^aKombinationsholdet blev doseret med en blanding af procloraz (15 mg/kg), simazin (1.25 mg/kg), deltamethrin (1.25 mg/kg), Tribenuronmethyl (1.25 mg/kg) and methiocarb (1.25 mg/kg)

*Statistisk signifikant forskellig fra kontrolholdet (p<0.05)

^& Statistisk signifikant forskellig fra prochlorazholdet (p<0.05)

^§non-parametrisk test, data er ikke normalfordelt

^$Signifikant effekt af legemsvægt

Tabel 3.4.5. Legems-, lever- og uterusvægt for PND16 hunner

^aKombinationsholdet blev doseret med en blanding af procloraz (15 mg/kg), simazin (1.25 mg/kg), deltamethrin (1.25 mg/kg), tribenuronmethyl (1.25 mg/kg) and methiocarb (1.25 mg/kg)

*Statistisk signifikant forskellig fra kontrolholdet (p<0.05)

^& Statistisk signifikant forskellig fra prochlorazholdet (p<0.05)

Tabel 3.4.6. Legems- og organvægte for voksne hanner (PND 220)

Data repræsenterer middel ± SD fra 16 dyr per hold

^aKombinationsholdet blev doseret med en blanding af procloraz (15 mg/kg), simazin (1.25 mg/kg), deltamethrin (1.25 mg/kg), tribenuronmethyl (1.25 mg/kg) and methiocarb (1.25 mg/kg)

^¤Store nyrer hos et dyr i kontrolholdet

^#En lille testikel med histologiske forandringer

^$Signifikant effekt af legemsvægt

Makroskopisk og mikroskopisk vurdering af dyrene.

Testiklerne blev undersøgt makroskopisk og mikroskopisk på GD21, PND16 og PND220 for alle tre hold.

På GD 21 sås ingen makroskopiske forandringer i nogen af de 3 hold.

Hverken PND16 eller PND 220 sås nogle generelle makroskopiske forandringer.

En testikel (venstre eller højre) fra 1-4 hanner per kuld i 5-6 kuld per hold blev fixeret i Bouins fixativ. Et snit per testikel blev farvet med hæmatoxylin og eosin (HE) og undersøgt mikroskopisk. Hverken på GD21, PND 16 eller PND 220 var der nogen generelle dosis-relaterede forskelle mellem holdene.

3.4.6 Effekt på adfærd og sædkvalitet

For at undersøge om pesticiderne havde nogen vedvarende neurotoksisk effekt blev de voksne dyrs adfærd undersøgt. Der blev undersøgt for aktivitetsniveau, legeadfærd, hukommelse og indlæring i Morris Maze test og labyrinttest og endelig blev der lavet en 'Sweet preference test'. Alle disse tests er kendetegnede ved, at der er en signifikant forskel i adfærden hos de to køn. Både hunner og hanner blev undersøgt og der sås som ventet en statistisk signifikant kønsforskel i både labyrinttest, aktivitetstest og legeadfærdstesten. Det viste sig at prochloraz inducerede et signifikant forøget aktivitetsniveau og forøget indtag af sødestof i hanner, dvs. der sås tegn på feminisering af hannerne i to adfærdstests. Derudover sås ingen effekter på adfærden af de pesticid-eksponerede dyr.

Det blev undersøgt hvorvidt in utero eksponering med prochloraz og kombinationen af de 5 pesticider havde effekt på sædkvaliteten i voksne hanner (PND 220). Der sås en tendens til fald i antallet af sædceller i både prochloraz og kombinationsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen, men effekten var ikke statistisk signifikant (Fig 3.4.1). Der sås ingen effekt af stofferne på andelen af motile sædceller, sædcelle progressivitet samt hastighedsparametre mellem de tre grupper (Fig 3.4.2).

Figur 3.4.1. Effekt af in utero eksponering for prochloraz og kombinationen af de fem pesticider på sædkoncentrationen i voksne hanner (PND 220). Data er angivet som middel ± SEM for n=16.

Figur 3.4.2. Effekt af in utero eksponering for prochloraz og kombinationen af de fem pesticider på sædmotilitet i voksne hanner (PND 220). Data er angivet som middel ±SEM for n=16.

3.5 Konklusion på hormonforstyrrende effekter af 5 pesticider

Methiocarb og deltamethrin inducerede et østrogent respons målt ved øget MCF-7 celleproliferation mens tribenuron-methyl, prochloraz og simazin ikke havde nogen effekt. Kombinationen af en 1:1:1:1:1 ækvimolær blanding af de 5 pesticider gav ikke noget målbart østrogent respons og beregning af en isobolkoeficient på 7 for blandingen indikerer en antagonistisk effekt af stofferne i blandingen, sandsynligvis forårsaget af prochloraz, som også reagerer antiøstrogent, når det blev testet sammen med 17β-østradiol.

Prochloraz, methiocarb og deltamethrin blokerede AR in vitro, men hverken tribenuron-methyl eller simazin havde nogen antiandrogen effekt. Kombinationen af en 1:1:1:1:1 ækvimolær blanding af de 5 pesticider gav et antiandrogent respons, der lå på linie med det predikterede respons under antagelse af additivitet. Resultaterne indikerer, at stofferne i kombination virker additivt i dette assay.

In vivo Hershberger forsøget blev kompliceret af, at det ikke var muligt at undersøge pesticiderne ved samme dosis-niveau. Både deltamethrin og methiocarb inducerede neurotoksiske effekter (deltamethrindyrene fik krampe og måtte hurtigt aflives) og derfor måtte dosis af de to stoffer sænkes til 2.5 mg/kg/dag, mens prochloraz, simazin og tribenuron-methyl blev doseret med hver 25 mg/kg/dag. Kombinationsgruppen fik en dosis svarende til i alt 80 mg/kg (25+25+2.5+25+2.5 mg/kg). Mht. effekt på vægte af reproduktionsorganer sås ingen effekter af enkeltstofferne, hvorimod kombinationsgruppen viste signifikant reducerede vægte af m. levator ani/bulbocavernosus. Der var også tendens til fald i prostatavægte og sædblærevægte, men der var ingen statistisk signifikans. Generelt sås ingen effekt på de valgte hormonniveauer. Derimod var der markant effekt af alle pesticider doseret enkeltvis og i kombination på ekspressionen af ODC mRNA og PBP C3 mRNA, med undtagelse af deltamethrin, tribenuronmethyl og kombinationen, der ikke gav effekt på PBP C3 mRNA.

Konklusionen er, at de 5 pesticider udviser tydelig additivitet in vitro ved binding til AR og at der generelt ikke ses de store effekter på reproduktionsorganvægte og hormonniveauer in vivo efter korttids-eksponering til de valgte dosisniveauer. Dog sås en akkumulerende effekt af kombinationen på vægte af m. levator ani/bulbocavernosus. Det var ikke overraskende, at deltamethrin og methiocarb, der viste antiandrogen effekt in vitro ikke gav nogen antiandrogen effekt på reproduktionsorganer, da de kun kunne testes ved en lav dosis på 2.5 mg/kg pga. anden toksicitet. Prochloraz har tidligere vist antiandrogen effekt in vivo ved 50 mg/kg, men vi kunne konstatere at det ikke havde denne effekt ved 25 mg/kg.

Det var overraskende at mange af enkeltstofferne inducerede så markante effekter på ekspression af PBP C3 og ODC mRNA. Tilsyneladende er genekspressionen i disse forsøg en mere følsom parameter end organvægte og hormonniveauer. Betydningen af disse ændringer er uklar på nuværende tidspunkt, men kan indikere en begyndende antiandrogen effekt, som ikke giver sig udslag på organ- og hormonniveau.

Undersøgelse af hormoninducerede effekter i afkommet efter in utero eksponering anses for at være den ultimative test for undersøgelse af hormonforstyrrende effekter. Kombinationen (20 mg/kg/dag bestående af 15 mg/kg prochloraz og 1.25 mg/kg af de 4 andre pesticider) og prochloraz i sig selv (30 mg/kg/dag) havde en reversibel effekt på mødrenes vægt under drægtigheden, men der sås ingen markante føtotoksiske effekter ved de valgte doser. Den oprindeligt valgte dosis af kombinationen (40 mg/kg/dag bestående af 30 mg/kg prochloraz og 2.5 mg/kg af de 4 andre pesticider) viste sig at være for høj, da der var synlige toksiske effekter på mødrene efter nogle få doser. Denne toksicitet må skyldes enten deltamethrin, methiocarb, simazin eller tribenuron-methyl i blandingen.

Både prochloraz og kombinationen forårsagede et markant reduceret testosteronniveau og et forhøjet progesteronniveau i hanfostre ved GD21. Det reducerede testosteronniveau afspejler en antiandrogen effekt i lighed med den, der er observeret for flere phthalater. Effekten var forsvundet ved PND16. Men det er givetvis denne effekt, der giver sig udslag i, at begge behandlinger giver et øget antal brystvorter og dermed en feminisering af hannerne. Det øgede progesteronniveau i hanfostre hænger sandsynligvis sammen med den øgede længde af drægtigheden, som var signifikant forøget efter prochloraz behandling.

Det er sandsynligt, at det er prochloraz i kombinationen (15 mg/kg) der forårsagede de antiandrogene effekter på testosteronniveau og brystvorteantal, da stoffet indgivet alene i en dosis på 30 mg/kg gav de samme effekter. Det kan dog ikke udelukkes, at et eller flere af de andre stoffer kan have bidraget til disse effekter.

Prochloraz og kombinationen forårsagede en ændringen i vægten af bulbourethral kirtlen på PND 16. Dette skyldes formentlig primært den antiandrogene effekt af prochloraz, da effekten ikke var større i kombinationsholdet. Effekten var ikke længere tilstede hos de voksne dyr. Kombinationen eller prochloraz alene forårsagede ikke yderligere dosis-relaterede organ forandringer.

Kombinationen gav ingen effekter på hverken adfærd eller sædkvalitet hos hannerne, hvorimod prochloraz i sig selv resulterede i en ændret adfærd hos hannerne i tests for aktivitetsniveau og sødestofpræference, og de fundne adfærdsændringer tyder på en feminisering af hannerne.

Der sås ingen statistisk signifikant effekt af hverken prochloraz eller kombinationen på sædkvaliteten, men der var en tendens til forringet sædkvalitet i begge pesticid-grupper.

Der var tydelige antiandrogene og dermed hormonforstyrrende effekter af prochloraz og i flere tilfælde sås de samme effekter i kombinationsgruppen. Dette tyder på, at det er prochloraz som er ansvarlig for de effekter, der er set for blandingen. Alt i alt viser resultaterne, at in utero forsøget som ventet var det mest sensitive system, hvor der sås både morfologiske, hormonelle og funktionelle ændringer efter pesticideksponering.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Juni 2004, © Miljøstyrelsen.