Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 88 – Hormonforstyrrende effekter af kombinationer af pesticider

Hormonforstyrrende effekter af kombinationer af pesticider

4 Samlet diskussion og konklusion

Sammenfattende tyder resultaterne fra denne rapport på, at hormonforstyrrende stoffer, der virker via samme virkningsmekanisme, virker additivt både i cellekulturforsøg og i dyreforsøg. Dette understøttes af den viden, man har fra litteraturen fra forsøg med andre cellekultursystemer. Det er bl.a. vist, at når man kombinerer en række enkeltstoffer ved koncentrationer, der ikke i sig selv har nogen effekt, så vil blandingen af stofferne give en effekt (Rajapakse et al. 2002). Dette er i overensstemmelse med hvad teorien omkring koncentrations-additionsprincippet prædikterer, som anvendelsen af isobolmetoden bygger på. Dette er første gang at kombinationseffekter for antiandrogene pesticider er undersøgt både in vitro og in vivo.

Fungicidet prochloraz er påvist at være antiandrogent in vitro samt in vivo i voksne hanrotter (Vinggaard et al., 2001) og som nu påvist i denne undersøgelse også efter eksponering under drægtigheden (in utero eksponering). På Environmental Protection Agency i USA har man også testet in utero effekter af prochloraz og har fundet den samme effekt på føtale testosteron- og progesteronniveauer (Wilson et al. 2003). Prochloraz må derfor betragtes som muligt reproduktionstoksisk for mennesker. At de godkendte guide-line tests, der anvendes ved godkendelse af pesticider, ikke er tilstrækkelige til at afsløre hormonforstyrrende effekter ses f.eks. af at prochloraz ved sidste godkendelse i 1998 ikke blev fundet reproduktionstoksisk, ligesom der ikke nævnes noget om eventuelle hormonforstyrrende egenskaber. Der er således behov for, at de nuværende guidelines for testning af pesticider udbygges til også at omfatte undersøgelser af stoffernes hormonforstyrrende potentiale.

In vivo undersøgelsen af de 5 pesticider, der bruges indenfor dansk gartneri og landbrug viste, at kombinationen af pesticiderne havde en markant effekt på kønshormonproduktion i hanfostre. Dette skyldes sandsynligvis tilstedeværelse af prochloraz i blandingen, da dette stof alene gav de samme effekter. En sådan antiandrogen effekt, der giver sig udslag i reduceret testosteronniveau i rottefostre, er også observeret for phthalaterne og menes at være den vigtigste mekanisme, der er involveret i de reproduktionsskadelige effekter af phthalaterne. Derfor er der grund til at undersøge eventuelle reproduktionsskadende effekter af dette fungicid mere indgående.

Både methiocarb og deltamethrin har hormonforstyrrende effekter in vitro, men vi kan konstatere, at når det gælder toksicitet i rotter, er det andre toksiske effekter af disse pesticider, der dominerer over de hormonforstyrrende effekter. Bortset fra det vil man forvente, at pesticiderne vil kunne bidrage til den samlede humane eksponering for hormonforstyrrende stoffer via additive effekter, selv om man ikke for enkeltstofferne kan påvise effekter på hormonsystemet in vivo.

Resultaterne i denne rapport og de få tidligere undersøgelser af kombinationseffekter in vitro af østrogene kemikalier tyder på, at hormonforstyrrende stoffer med samme virkningsmekanisme (f.eks. blokering af AR, aktivering af ER) virker additivt. Resultaterne fra rotteforsøgene i denne undersøgelse tyder på, at det samme gør sig gældende in vivo. Når man skal vurdere den humane risiko ved udsættelse for hormonforstyrrende stoffer er det således ikke tilstrækkeligt at se på udsættelsen for et enkelt hormonforstyrrende stof ad gangen. Endvidere vil selv meget lave eksponeringer for hormonforstyrrende stoffer kunne bidrage til det samlede respons, selvom effekten af det enkelte stof ligger under detektionsgrænsen. Dette er indtil videre dokumenteret in vitro for østrogene stoffer (Rajapakse et al., 2002, Silva et al., 2002). I stedet for vil det være langt mere relevant at se på den samlede belastning for stoffer med samme virkningsmekansme. Det vil imidlertid være meget vanskeligt at vurdere befolkningens og det enkelte individs samlede eksponering ud fra oplysninger om kost, levevaner, arbejdsforhold osv. Dertil kommer at alle hormonforstyrrende stoffer næppe er identificeret endnu. En langt bedre fremgangsmåde vil være at etablere pålidelige målemetoder til at vurdere eksponeringen. En lovende fremgangsmåde til at måle den samlede eksponering for østrogene kemikalier blev publiceret af Sonnenschein, Soto og deres medarbejdere i 1995 (Sonnenschein et al 1995). Metoden er siden blevet videreudviklet (Soto et al., 1997, Rivas et al., 2001, Nielsen et al., 1998). Princippet i metoden er, som beskrevet tidligere i rapporten, at naturligt producerede og farmaceutiske østrogener fjernes fra en opkoncentreret blodprøve som herefter testes i MCF-7 celleproliferationsassayet. For nylig er biomarkørmetoden blevet anvendt til at vurdere og sammenligne belastningen for østrogene stoffer i en gruppe af danske og færøske kvinder (Rasmussen et al., 2003). Et forhøjet østrogent respons var langt hyppigere blandt de færøske kvinder end blandt de danske kvinder, hvilket antages at hænge sammen med et højt indhold af østrogene stoffer ophobet i hvaler og fisk, som udgør en stor del af den færøske kost. Det var ikke muligt at identificere nogle specifikke kemiske stoffer i blodprøverne, som korrelerede direkte med det østrogene respons, hvilket sandsynlivis skyldes, at der måles på det samlede respons med bidrag fra både østrogene stoffer, østrogene metabolitter samt antiøstrogene stoffer. Ved at undersøge blodprøver fra rotter doseret direkte med østrogene stoffer i denne undersøgelse, ønskede vi at validere biomarkørmetoden ved at påvise en dosis-respons sammenhæng mellem pesticiddosis og det østrogene serumrespons. Dette blev klart demonstreret, selv om responset ved de højeste pesticiddoser er usikkert, fordi der ikke var så meget blod som ønskeligt til rådighed. I forbindelse med et projekt finansieret af Statens Sundhedsvidenskabelige Forskningsråd valideres metoden yderligere i rotteforsøg, hvor rotterne er eksponeret for andre østrogene eller antiøstrogene pesticider. Desuden er blodprøver fra ca. 400 kvinder som på blodprøvetagningstidspunktet arbejdede i fynske blomstergartnerier ved at blive analyseret på SDU, Odense. Resultaterne vil blive sammenholdt med en række andre målinger samt detaljerede oplysninger om kvindernes pesticideksponering i tiden op til prøvetagningen.

De in vitro metoder der anvendes til testning for østrogene/antiøstrogene samt androgene/antiandrogene stoffer er typisk MCF-7 celleproliferationsassayet, ER og AR reportergen assays samt ER og AR bindingsassays. Mens bindingsassays kun detekterer stoffernes affinitet overfor receptorene og ikke kan skelne mellem agonister og antagonister, er de andre assays i højere grad i stand til at forudsige det funktionelle biologiske respons. En detaljeret diskussion af fordele og ulemper ved de forskellige in vitro assays ligger udenfor denne rapports formål (se eventuelt Andersen et al., 1999). Vi finder, at MCF-7 celle proliferatinsassayet samt reportergen assays baseret på mammale celler er de bedst egnede, og disse metoder har både i denne undersøgelse og i tidligere undersøgelser vist sig at være rimelig gode til at forudsige effekter in vivo (Vinggaard et al., 2002, Yamasaki et al., 2002) selv om metoderne naturligvis ikke kan tage højde for betydningen af absorption, fordeling, ekskretion og metabolisme i en hel organisme. Dette kan f.eks. resultere i at stoffer, som er meget potente in vitro, er mindre potente in vivo og omvendt afhængig af nedbrydningstid og om det overvejende er stoffet selv eller metabolitter, der er biologisk aktive. Et stof, som giver et signifikant respons in vitro, bør dog betragtes som muligt hormonforstyrrende indtil en eventuel in vivo effekt er afkræftet i pålidelige undersøgelser. Selv da kan det dog tænkes at spille en rolle og bidrage til en samlet sundhedsskadelig belastning. Hvad angår testning af blandinger af kemsike stoffer er der dog ingen tvivl om, at in vitro metoder må spille en afgørende rolle, da der kun i begrænset omfang vil være muligt at undersøge dette in vivo.

Et af de spørgsmål, der ofte stilles i forbindelse med risikovurdering af stoffer er, hvorvidt genekspressionsanalyser kan anvendes i den sammenhæng eller ej. Som udgangspunkt mener vi, at genekspressionsændringer skal ses i sammenhæng med andre morfologiske, funktionelle eller biokemiske ændringer i organismen. I de tilfælde kan de være et værdifuldt supplement og sige noget om stoffets virkningsmekanisme. I andre tilfælde, hvor der udelukkende observeres genekspressionsændringer, kræves der et nøje kendskab til genets regulering, vævslokalisering og gerne dets funktion, men ofte mangler der pt. viden på det område. For at udbygge denne viden er det derfor fortsat vigtigt at inddrage genekspressionsanalyser i toksikologiske undersøgelser.

Forskellige gener aktiveres og deaktiveres hele tiden afhængig af celle- eller vævstype, det cellulære stimulus og signalvej. For at etablere en specifik genekspression som en biomarkør for eksponering af væv eller celler, er det nødvendigt, at dosis-respons- og tidsstudier bliver udført, før det kan bruges i forbindelse med risikoidentifikation. For eksempel er østradiol, som er anvendt i vores dyrestudier, undersøgt for tids-afhængig effekt på ER og ER mRNA ekspression i et cellekulturstudie. Det viste sig, at østradiol bevirkede en nedregulering af ER og ER mRNA efter 48 timer, hvorimod der sås en stigning af ER efter 24 timer (Hofmeister & Bonefeld-Jørgensen, Toxicology In vitro 2004(in press).

I vores forsøg tyder meget på, at analyser af ekspression af PBP C3 og TRPM-2 mRNA er anvendelige som markører for antiandrogen virkning i forsøgsdyr. Dog har vi observeret, at i nogle forsøg med visse stoffer synes de at være en tidlig og følsom markør, hvorimod i andre forsøg med andre stoffer har det vist sig at være en mindre følsom markør end f.eks. reproduktionsorganvægte. I de forsøg kigger vi udelukkende på genekspressionen på et enkelt tidspunkt i dyrets liv, og der kan være variationer i den tid der går fra sidste dosering til dyret aflives, selv om den parameter forsøges standardiseret. Hvorvidt disse forhold har afgørende betydning er pt. uklart og det er derfor nødvendigt med mere forskning på området for at kunne drage nogle endelige konklusioner.