|
Hudpenetration af pesticider 2 Metode2.1 In vitro model Effekten af hjælpestoffer og aktivstoffer på såvel barrierefunktion som penetration af huden undersøges i en in vitro diffusionscellemodel ved anvendelse af human hud. Modellen er beskrevet i OECD’s guidelines for undersøgelse af hudpenetration (11) og er særdeles relevant for denne type undersøgelser, idet hudens barrierefunktion overvejende er bestemt af det epidermale lag af døde celler, stratum corneum (12). Den eksperimentelle model tillader kvantitering og sammenligning af både transport igennem og temporær deposition i huden. Modellen er tidligere anvendt og valideret overfor enkelte udvalgte hjælpestoffer (13) og har vist en god overensstem.melse med in vivo hudpenetrationsforsøg på mennesker (11,14). Modellen er den bedste eksperimentelle mulighed for at tilvejebringe systematisk viden. Der er udvalgt relevante hjælpestoffer og et mindre antal aktivstoffer, som er evalueret alene og i kombination.
Figur 1. Diffusionscelle af glas til penetrationsforsøg. 2.1 In vitro modelDiffusionscellerne er af håndblæst glas og består af et donorkammer og et receptorkammer (figur 1). Huden, der stammer fra abdominalplastikker eller brystreduktioner foretaget på Odense Universitets-hospitals plastikkirurgiske afdeling, præpareres (se appendix 1), monteres på et stålgitter og placeres mellem de to kamre med stratum corneum vendende mod donorkammeret. Der er i samtlige forsøg anvendt fuldhud med en tykkelse på 0,7-1,0 mm. Udtørring af huden ved fordampning undgås ved at dække donorcellen med parafilm. Receptorvæsken der fylder receptor-kammeret omrøres konstant (magnetomrøring) for at undgå en koncentrationsgradient mellem top og bund i receptorkam.meret. Receptorvæsken er 50 % ethanol i alle forsøg bortset fra forsøgene med lettere beskadiget hud, hvor receptorvæsken var isotonisk saltvand. Diffusionscellerne placeres i vandbad (35oC ) for at sikre en temperatur på omkring 32oC på hudoverfladen, svarende til normal hudtemperatur. Hudens integritet sikres ved kapacitansmå.ling før forsøg påbegyndes. 2.2 Eksperimentelt designEt fast volumen af hjælpestof, aktivstof eller blanding heraf appliceres på huden i donorkammeret. Der udtages med fastsatte intervaller prøver fra receptorkammeret af de applicerede stoffer. Det udtagne volumen erstattes med frisk receptorvæske, således at receptorvolumen holdes konstant. Koncentrationen af hjælpestof og aktivstof måles i de udtagne prøver. Ved gentagne udtagninger over tid vil fluxen af hjælpestof og aktivstof kunne bestemmes. Under forsøgene er der udtaget prøver efter typisk 3, 6, 24, 30, og 48 timer. I de seneste forsøg er der dog også taget prøver efter 12 timer med henblik på en bedre bestemmelse af specielt lag-time. De i receptorvæsken målte pesticid-koncentrationer danner basis for penetrationskurver ud fra hvilke, den totale penetration over 48 timer samt penetrationshastigheden (fluxen) kan bestemmes. Kurveforløbene i nærværende forsøg kan beskrives ved en initiel periode (lag-fase), hvor der endnu ikke kan observeres nogen penetration. Lag-fasens udstrækning er ikke et udtryk for, at der ikke trænger pesticid ind i huden, men et udtryk for hvor lang tid der går, før pesticidet trænger gennem huden. Efter lag-fasen observeres en penetration resulterende i stadig stigende koncentration af pesticid i receptorvæsken og dermed i de udtagne prøver. En kurve over penetrationen over tid har et tilnærmelsesvis sigmoidt forløb. Hældningen på den kurve er udtryk for penetrationshastigheden og betegnes fluxen. Da lag-fasens udstrækning varierer både mellem donorer og mellem pesticider, vil det kun sjældent være muligt at udtage prøver præcis ved den første gennemtrængning af hudmembranen. Lag-fasens udstrækning estimeres ved at ekstrapolere penetrations-kurverne baglæns. Den rapporterede flux er den maksimale flux observeret gennem forsøgsperioden. Alle tre mål har relevans i vurderingen af penetrationskarakteristika for et givet stof. Den totale mængde penetreret over en bestemt periodes eksponering, fx 48 timer, anvendes ofte som basis for risikovurdering eller anbefalinger i relation til anvendelse af handsker i arbejdsmiljøsituationer. Tallet bør dog, som det fremgår af nedenstående figur (figur 2) ikke stå alene, men suppleres med de to kinetiske mål, flux samt lag-time. Figuren viser således, at samme totale penetration kan fremkomme på basis af to helt forskellige penetrationskurver. I arbejdsmiljøsammenhænge vil der således ikke være tvivl om, hvilket stof man ville foretrække ved en eksponeringstid under 4-5 timer, medens anbefalingen muligvis ville ændres ved eksponeringstider omkring 6 timer eller længere.
Figur 2. Teoretiske penetrationskurver for to stoffer med identisk totalpenetration efter 6 timer, men forskellig lag-time og flux. 2.3 Variabilitet og statistikAnvendelsen af hud fra forskellige donorer betinger en naturlig heterogenicitet med deraf følgende interindividuel variation. Den intraindividuelle variation er imidlertid mere begrænset, og ved at sikre repræsenta.tion af samme donor i både eksperimentel og kontrolgruppe kan man opnå valide resultater med gruppestørrelser på 6-8 diffusionsceller per stof (9,10). Tidligere forsøg har vist, at huden opretholder fuld barrierefunktion i over 72 timer, hvilket muliggør både kortere og længere eksponeringsperioder. Grundet gruppestørrelsen og en erfaringsmæssig venstreforskydning af fordelingskurven anvendes som udgangspunkt non-parametrisk statistik. 2.4 Kemiske analyserMåling af mængden af pesticid i en prøve sker ved spektrofotometrisk måling i forhold til en standardkurve efter en primær separation ved hjælp af et HPLC apparatur (9). Separationen på HPLC sker, ved at stofferne presses gennem en kolonne, hvor stofferne tilbageholdes i forskellig grad afhængig af deres polaritet. Såfremt to stoffer ligner hinanden kemisk, vil de derfor potentielt kunne interferere ved HPLC analyse. Ved analyse af kombinationsforsøgene viste det sig vanskeligt at adskille to af pesticiderne ved den hidtidige anvendte separation på HPLC, hvorfor der måtte anvendes en del ressourcer (=tid) på ændring og optimering af HPLC gradient/løbevæske for at muliggøre valid måling af begge pesticider. Det er således alene separationen, der er ændret, medens kvantificeringen af de tre pesticider er identisk med tidligere forsøg (9). Tabel 1. Kemiske karakteristika for anvendte modelstoffer.
2.5 Delstudier2.5.1 Delstudie 1 – Hjælpestoffers egeneffektI dette delstudie sammenlignes tre udvalgte hjælpestoffer med betydelig anvendelse i Danmark med nonylphenolethoxylat med hensyn til effekt på hudens barrierefunktion og på medierende effekt over for udvalgte modelstoffer. 2.5.2 Delstudie 2 - KombinationseffekterFolk, der arbejder i væksthuse, eksponeres ofte for pesticider ved almindelig håndtering af pesticidbehandlede planter. Pesticiderne anvendes og udlægges i en formulering, der bl.a. indeholder hjælpestoffer. Disse hjælpestoffers potentielle mulighed for at øge absorptionen af det aktive pesticid er generelt ukendt. I delstudie 2 undersøges et antal pesticider med relevans for danske forhold i deres tekniske salgsformulering, som aktivt stof alene og desuden i kombination med forskellige hjælpestoffer og andre aktivstoffer. De alternative hjælpestoffer er udvalgt på basis af resultaterne fra delstudie 1. 2.5.3 Delstudie 3 – Handskers beskyttelseseffektArbejdsprocedurer ved håndtering af pesticider foreskriver ofte brug af handsker. Hjælpestoffers evne til at øge handskegennemtrængeligheden af forskellige humanrelevante kemiske forbindelser er stort set ikke undersøgt bortset fra et enkelt studie af permeabiliteten over for natrium lauryl sulfat (16). I delstudie 3 vil handskemateriale blive placeres ovenpå stratum corneum og den integrerede barrierefunktion vurderet efter eksponering til aktivstoffer og hjælpestoffer eller kombinationer heraf. Relevante handskematerialer (latex og nitril) undersøges. 2.5.4 Delstudie 4 – Penetration gennem beskadiget hudUndersøgelser af penetrationsegenskaber og mulige effekter på hudens mere generelle barrierefunktion gennemføres både in vivo og in vitro på mennesker såvel som forsøgsdyr. I alle tilfælde gøres en betydelig indsats for at sikre at den undersøgte hud er intakt, ensartet og med optimale barriereegenskaber. Imidlertid kendetegnes virkeligheden hos den enkelte medarbejder ofte af en hudstatus, der er markant ringere i forhold til intakte barriereegenskaber. Der kan således være tale om at længere tids arbejde med fugtige planter, at vand har opblødt hænderne, eller tilstedeværelse af smårifter og irriteret hud. Denne virkelighed afspejles ikke i hidtidige guidelines (9) samt gennemførte eksperimentelle studier, og betydningen i kvantitative termer for mængden af absorberet fremmedstof er stort set ukendt, men generelle skøn nævner muligheden for en 2-9 ganges forøget penetration (17). I delstudie 4 er en eksperimentel model med lettere beskadiget hud valideret og anvendt til belysning af betydningen af en beskadiget hud for dermal penetration af udvalgte pesticider.
|
