Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 90 – Hudpenetration af pesticider – 3 Delstudie 1

Hudpenetration af pesticider

3 Delstudie 1 - hjælpestoffers egeneffekt

3.1 Baggrund
3.2 Formål
3.3 Valg af hjælpestoffer
3.4 Eksperimentel model
3.5 Praktisk forsøgsforløb
3.6 Gennemførte forsøg
3.7 Resultater
3.8 Resultat-oversigt
3.9 Konklusion på hjælpestoffers egeneffekt

3.1 Baggrund

Visse hjælpestoffer vides at påvirke hudens barrierefunktion. Ved substitution er det således væsentligt at anvende stoffer, der ikke i sig selv nedsætter hudens barrierefunktion.

3.2 Formål

Formålet med dette delstudie var at sammenligne udvalgte hjælpestoffers egeneffekt over for hudens barriereegneskaber. Referencerammen er vand, som vides ikke at påvirke barrieren, SLS (natrium lauryl sulfat; Sigma; MW = 288.4g/mol), som vides at kompromittere barriereintegriteten, samt nonylphenolethoxylat (12 æter-grupper; Promochem GmbH; MW= 748 g/mol), der hidtil har været anvendt i betydeligt omfang som hjælpestof i salgsformuleringen af flere bekæmpelsesmidler.

3.3 Valg af hjælpestoffer

De to hyppigst anvendte hjælpestoffer, propylenglycol (Fluka; MW = 76.1 g/mol) og ethylenglycol (Prolabo; MW = 62.1 g/mol), samt lignosulfonsyre (Aldrich; højmolekylært polymerprodukt med MW = 18,000-52,000 g/mol) er anvendt i nærværende undersøgelse. Valget af hjælpestoffer er baseret på oplysninger fra Miljøstyrelsens pesticidkontor (via Pia Berthelsen, Fødevaredirektoratet) om forbrugsmønster for hjælpestoffer i Danmark. Alle tre hjælpestoffer er på den prioriterede liste for stoffer, om hvilke man ønsker EU-risikovurdering. Denne undersøgelse fokuserer på hjælpestoffernes påvirkning af hudens barriereegenskaber, medens en diskussion af hjælpestoffernes potentielle helbredseffekter kan findes hos Tobiassen et al. (18,19).

3.4 Eksperimentel model

Den i indledningen beskrevne model (pkt. 3.4) samt eksperimentelle design (pkt. 3.5) er anvendt. Hudbarrierens integritet er således vurderet ved måling af kapacitansændringer over tid samt ved måling af penetration af tritieret vand. De to metoder har tidligere vist sig kvalitativt at stemme overens i forhold til information om hudens integritet, hvorfor kommende delstudier involverende pesticidanalyser primært vil anvende kapacitansmålet som indikation for den initiale status for hudens barrierefunktion.

3.5 Praktisk forsøgsforløb

Dag 1 opsættes celler med human hud. Efter 16-20 timer kontrolleres hudens integritet ved kapacitansmåling. Anvendelige celler tilsættes donorstof. Der måles kapacitans og udtages prøver på fastlagte tidspunkter i løbet af de følgende 48 timer. Herefter afsluttes forsøget, og udtagne prøver fra receptorkammeret måles (beta-tæller). En forsøgsserie strækker sig således over knap 4 arbejdsdage plus analysetid.

3.6 Gennemførte forsøg

Nedenfor fremgår de undersøgte stoffer samt de anvendte koncentrationer, der er valgt således, at den højeste er større end de i færdigprodukter normalt anvendte koncentrationer.

	Nonyl- phenol- ethoxylat	Natrium lauryl sulfat (SLS)	Ethylen- glycol	Propylen- glycol	Ligno-sulfonsyre
Konc.	2.5 mM	0.2% (7mM)	2.5 mM	2.5 mM	1.0%(~0.25mM)
Konc.	10 mM	1.0% (35mM)	10 mM	10 mM	4.0% (~1mM)

3.7 Resultater

Der er en meget begrænset variation mellem de gennemsnitlige kapacitanser til tiden t=0 (tabel 2). Resultaterne viser således en høj grad af ensartethed i forhold til udgangspunktet for vore eksperimentelle undersøgelser. Kapacitansen på celler udsat for SLS øges signifikant med tiden, ligesom dosis også ses at have indflydelse. Penetrationen af tritieret vand i SLS-behandlede celler når 300-400% af kontrollen (tabel 2). Som det eneste blandt de øvrige hjælpestoffer, der er anvendt, øger nonylphenol-ethoxylat markant kapacitansen, dog kun ved den højeste koncentration. De resterende hjælpestoffer synes således ikke at påvirke integriteten af hudbarrieren målbart. Trods bevaret integritet ses dog en næsten fordoblet penetration af tritieret vand efter behandling med flere af hjælpestofferne. Som eneste af de testede hjælpestoffer synes lignsulfonsyre faktisk at stabilisere barrierefunktionen, således at den tidsrelaterede nedsættelse af hudens integritet i forsøgsopstillingen udskydes (tabel 2). Denne længere tids opretholdelse af fuldt intakt barriere resulterer da også i en mindre penetration end i kontrollerne med rent vand (tabel 2).

Tabel 2. Resultater fra undersøgelse af hjælpestoffers egeneffekt på hudens integritet. Kapacitans er målt ved forsøgets begyndelse, efter knapt et døgn samt ved forsøgsafslutning medens penetration af tritieret vand er opgjort over 48 timer.

Hjælpestof		Kapacitans (nF)			Penetration af H₂O (% af vand)
Navn	Konc. (mM)	t = 0 timer	t = 21 timer	t = 48 timer	Penetration af H₂O (% af vand)
Vand (neg. kontrol)		40	43	65	100
SLS (pos. kontrol)	7 (0.2%)	46	345	840	340
SLS (pos. kontrol)	35 (1.0%)	27	461	7180	410
Ethanol (24%)		34	40	46	180
Nonyl-phenol-ethoxylat	2.5	37	44	58	190
Nonyl-phenol-ethoxylat	10	47	109	124	220
Ethylen-glycol	2.5	44	53	57	220
Ethylen-glycol	10	42	44	52	110
Propylen-glycol	2.5	55	61	74	290
Propylen-glycol	10	43	46	50	110
Lignosul-fonsyre	0.25	33	34	35	66
Lignosul-fonsyre	1.0	41	44	47	89

3.8 Resultat-oversigt

vand:	fungerer som negativ kontrol, og viser da også intakt barrierefunktion efter 48 timer.
SLS:	positiv kontrol, og resultater viser en dosis- og tidsafhængig nedbrydelse af hudens barrierefunktion. Den mest markante og følsomme effektparameter er kapacitansmålingen.
Ethanol:	hyppigt anvendt opløsningsmiddel mhp øget vandblandbarhed. Øger penetrationen af tritieret vand (180%) uden at påvirke kapacitansen signifikant.
Nonylphenol:	2.5 mM påvirker ikke kapacitans, hvorimod penetration af tritieret vand næsten fordobles. Den højere koncentration (10 mM) fordobler såvel kapacitans som mængden af tritieret vand, der penetrerer i løbet af 48 timer.
Ethylenglycol:	påvirker ikke kapacitansen, medens penetrationen af tritieret vand er fordoblet ved den lave koncentration.
Propylenglycol:	påvirker ikke kapacitansen, medens penetrationen af tritieret vand er tredoblet ved den lave koncentration.
Lignosulfonsyre:	påvirker ikke kapacitans eller penetration af tritieret vand ved hverken høj eller lav koncentration.

3.9 Konklusion på hjælpestoffers egeneffekt

De tre undersøgte hjælpestoffer (ethylenglycol, propylenglycol, lignosulfonsyre) er velegnede da de ikke synes at øge kapacitansen. Imidlertid øger begge glycoler penetrationen af vand markant. Efter diskussion i følgegruppen besluttedes at begrænse efterfølgende delstudier til anvendelse af to hjælpestoffer: ethylenglycol samt propylenglycol.