|
Hudpenetration af pesticider 4 Delstudie 2 – kombinationseffekter4.1 Aktivstoffer 4.1 AktivstofferVariabiliteten i hudpenetration mellem enkeltindivider beskrives ofte som værende omkring 50 %, hvorfor man normalt tilstræber, at flere donorer indgår i et eksperimentelt setup, ligesom antallet af celler per gruppe typisk er 8-10. Nedenstående data (Tabel 3-5) demonstrerer denne variabilitet, men understøtter også, at det ved anvendelse af tilstrækkeligt antal celler er muligt at opnå en rimelig datakvalitet. Andre publicerede undersøgelser beskriver en lag-time for pirimicarb på 18 timer, hvilket svarer til nærværende data (Tabel 5). Sammenlignes methiocarb og pirimicarb ses markante forskelle både hvad angår lag-time og flux. Lag-time er således halv så lang for methiocarb (Tabel 8), ligesom flux'en er noget større. Samlet set, giver det en ganske betydelig større hudpenetration over 48 timer. Årsagen til forskellene mellem de to pesticiders penetrationsegenskaber skal ikke findes i deres størrelse, idet molvægtene er ret ens (225 kontra 238 g/mol), men derimod i deres opløseligheder, hvor methiocarb har en logPow på 3.3 sammenlignet med pirimicarbs 1.7. LogPow er et mål for forholdet mellem opløseligheden i octanol og i vand, og en lavere logPow betyder altså en højere grad af vandopløselighed og dermed en under normale omstændigheder dårligere evne til at passere membraner. De praktiske resultater synes således at stemme overens med de teoretiske overvejelser. Det bør endvidere bemærkes, at flere opslagsværker beskriver hudabsorptionen af disse to pesticider som særdeles begrænset. Det kunne formodes, at denne konklusion var baseret på studier med observations-perioder under 8 timer. Begge pesticider har i den anvendte eksperimentelle opsætning en lag-time omkring 8-15 timer, hvilket betyder, at forebyggende tiltag i form af regelmæssig håndvask burde have en virkning. Imidlertid tager lag-time for de rene pesticider ikke højde for den mængde stof, der potentielt er absorberet i huden, men endnu ikke er penetreret. En undersøgelse af dette aspekt vil kræve et forsøgs-design, der anvender en begrænset eksponeringstid efterfulgt af en længere observationsperiode. Forsøg af denne karakter er under gennemførelse i forbindelse med det parallelt forløbende EU-projekt. Herudover vil der, som der vil fremgå senere, kunne findes ganske betydende forskelle mellem resultater opnået med rene stoffer og resultater opnået med brugsopløsninger. En manglende penetration af rene stoffer over 8 timer kan således ikke umiddelbart tages til indtægt for, at penetrationen under normale arbejdsforhold er fraværende og anvendelsen af handsker unødvendig. 4.2 Aktivstoffer + hjælpestofferDen perkutane penetration af de tre pesticider er undersøgt under tilstedeværelse af de to hjælpestoffer (ethylenglycol og propylenglycol). Kemiske analyser er gennemført for samples fra forsøgene med pirimicarb og methiocarb. Resultaterne fra forsøgene med pirimicarb viser, at de to hjælpestoffer øger fluxen lidt, ligesom lag-time nedsættes med 10-20 %. Samlet giver tilstedeværelse af ethylenglycol anledning til en 20 % forøget mængde penetreret pirimicarb i løbet af 48 timer, medens den tilsvarende forøgelse med propylenglycol er omkring 40 %. For methiocarb er effekten betydeligt mere begrænset, idet en hjælpestof-betinget forøget flux opvejes af en lettere forøget lag-time, der samlet giver anledning til næsten uændrede absorptionsdata over en 48 timer periode. Det er her væsentligt at bemærke de ændringer, som sker med lag-time, hvor man ved methiocarb ser en øgning, medens man ved pirimicarb ser en nedsættelse. Årsagen til netop denne parameters betydning er, at eksponeringstiden under normal anvendelse af produkterne er af kortere varighed. Set i lyset af de to hjælpestoffers neutrale egenskaber over for hudens barrierefunktion (delstudie 1) er de om end små effekter, der ses i nærværende delstudie, spændende, da de indikerer en facilitering af absorptionen af pirimicarb enten ved forøget passiv diffusion eller via binding mellem pesticid og hjælpestof. For methiocarb ses denne effekt ikke, men methiocarb er jo også i forvejen lettere absorberbart som følge af højere lipofilicitet (lavere vandopløselighed). Tabel 3. Effekt af ethylenglycol (EG; 10mM) og propylenglycol (PG; 10mM) på flux af pirimicarb (0.2mM) gennem human hud. Flux er udtrykt som medianværdier i enheden nmol/time x cm².
Tabel 4. Effekt af ethylenglycol (EG; 10mM) og propylenglycol (PG; 10mM) på penetreret mængde af pirimicarb (0.2mM) gennem human hud i løbet af 48 timer kontinuerlig eksponering. Mængden er udtrykt som medianværdier i enheden nmol/cm².
Tabel 5. Effekt af ethylenglycol (EG; 10mM) og propylenglycol (PG; 10mM) på lag-time for pirimicarb (0.2mM) gennem human hud. Lag-time er udtrykt som medianværdier i enheden timer.
Tabel 6. Effekt af ethylenglycol (EG; 10mM) og propylenglycol (PG; 10mM) på flux af methiocarb (0.2mM) gennem human hud. Flux er udtrykt som medianværdier i enheden nmol/time x cm².
Tabel 7. Effekt af ethylenglycol (EG; 10mM) og propylenglycol (PG; 10mM) på penetreret mængde af methiocarb (0.2mM) gennem human hud i løbet af 48 timer kontinuerlig eksponering. Mængden er udtrykt som medianværdier i enheden nmol/cm².
Tabel 8. Effekt af ethylenglycol (EG; 10mM) og propylenglycol (PG; 10mM) på lag-time for methiocarb (0.2mM) gennem human hud. Lag-time er udtrykt som medianværdier i enheden timer.
4.3 Kombinationseffekter mellem aktiv- og hjælpestofferErfaringer fra flere projekter med relation til danske gartnerier tilsiger, at flere bekæmpelsesmidler ofte optræder samtidig i samme kulturer, enten fordi man anvender dem samtidig, eller fordi man med ganske korte intervaller anvender dels bekæmpelsesmidler og dels retarderingsmidler. Derfor gennemføres en række eksperimenter med det mål at studere, hvorvidt den samtidige tilstedeværelse af pesticid-2 påvirker penetration, flux, og lag-time af pesticid-1 og omvendt. Alle tre pesticider (methiocarb, pirimicarb, paclobutrazol) anvendes alene eller parvis. Herudover undersøges, hvorvidt tilstedeværelsen af hjælpestoffer (SLS, ethylenglycol, propylenglycol) yderligere påvirker penetration og flux af de to pesticider i blandingen. Pesticiderne er anvendt i samme koncentration i forsøg med enkeltstoffer såvel som i kombinationsforsøgene. Man kunne argumentere for, at man i kombinationsforsøg burde sigte mod anvendelse af samme totalkoncentration af pesticid, hvilket ville betyde, at man i kombinationsforsøg med to pesticider skulle halvere koncentrationen af aktivstof. Vi har imidlertid valgt at bibeholde de oprindelige koncentrationer også i kombinationsforsøgene. Baggrunden herfor er, at man brugssituationen på gartnerier vil anvende midlerne med forskellige formål (fx paclobutrazol til retardering og methiocarb som bekæmpelsesmiddel), hvorfor man ikke vil sænke koncentrationerne. Koncentrationen af pesticiderne er således 0.2mM i alle forsøg, medens koncentrationen af hjælpestofferne propylenglycol, SLS, og ethylenglycol er henholdsvis 10mM, 7mM, og 10mM. 4.3.1 Resultater af kombinationsforsøgOverordnet dokumenterer resultaterne en metode med en ganske tilfredsstillende reproducerbarhed, der kommer til udtryk i de begrænsede variationer. Det skal i den forbindelse påpeges, at der i tabellerne er anvendt SEM-værdier. SEM beregnes ved at dele SD med kvadratroden af antallet af observationer, og anvendes i tilfælde, hvor man frem for sammenligning af enkeltværdier ønsker sammenligning af grupper alene. Da vi ved, at den individuelle variation mellem donorer er betydelig, er det alene sammenligninger på gruppebasis, der sigtes imod. 4.3.1.1 Methiocarb Tilstedeværelse af enten propylenglycol, ethylenglycol, eller SLS synes ikke at ændre på fraværet af markant indflydelse fra pirimicarb eller paclobutrazol på den dermale penetration af methiocarb (Tabel 9). Overordnet set, er der en tendens til, at de valgte hjælpestoffer mindsker den samlede dermale penetration af methiocarb over forsøgsperiodens 48 timer. Statistisk signifikans opnås dog kun for ethylenglycols indflydelse sammen med paclobutrazol på penetrationen af methiocarb. Effekterne er imidlertid begrænsede, idet en nedsat flux oftest er modsvaret af en nedsat lag-time, således at den samlede penetration over 48 timer er stort set uændret. SLS synes i begge kombinationsforsøg at reducere lag-time, mens ethylenglycol som det eneste af de anvendte hjælpestoffer ikke synes at påvirke de målte penetrations-karakteristika for methiocarb. Tabel 9. Effekt af kombineret eksponering for pirimicarb (0.2mM) eller paclobutrazol (0.2mM), samt effekt af tre hjælpestoffer på den dermale penetration og flux af methiocarb (0.2mM). Resultaterne på penetration gennem 48 timer og flux er givet som mean + SEM.
PG – Propylenglycol (10mM); SLS - Natrium Lauryl Sulfat (7mM); Sammenlignes penetration over 48 timer, flux, samt lag-time for methiocarb med tilsvarende resultater fra de tidligere forsøg (Tabel 6, 7, 8) ses, at der er forskelle. Årsagen er sandsynligvis, at der i de tidlige forsøg ikke blev udtaget prøver efter 12 timer, men først efter 24 timer. Herved har man ikke mulighed for at få den nedre del af den sigmoide penetrationskurve præsenteret. For et stof med en relativ kort lag-time og relativ høj flux betyder det, at man efter 24 timer har passeret sigmoidkurvens vendepunkt og derfor vil undervurdere den maksimale flux (idet den vil være til stede initialt inden 24 timer). Dette stemmer overens med, at der i de seneste forsøg, hvor der er datapunkter under 24 timer, findes en markant større maksimal-flux (Tabel 6 versus Tabel 9). Lag-time er ikke markant forskellig mellem de to forsøgsserier, og ligger mellem 6 og 10 timer. 4.3.1.2 Pirimicarb Tabel 10. Effekt af kombineret eksponering for methiocarb (0.2mM) eller paclobutrazol (0.2mM), samt effekt af tre hjælpestoffer på den dermale penetration og flux af pirimicarb (0.2mM). Resultaterne på penetration gennem 48 timer og flux er givet som mean + SEM.
PG - Propylenglycol (10 mM); SLS - Natrium Lauryl Sulfat (7 mM); Sammenlignes penetration over 48 timer, flux, samt lag-time for pirimicarb med tilsvarende resultater fra de tidligere forsøg (Tabel 3,4,5) ses, at der er forskelle. Årsagen er sandsynligvis, at vi i de tidlige forsøg ikke udtog prøver efter 12 timer, men først efter 24 timer. Herved har man ikke mulighed for at få den nedre del af den sigmoide penetrationskurve præsenteret. For et stof med relativ kort lag-time og relativ lav maksimal-flux betyder det, at man ikke har passeret sigmoidkurvens vendepunkt og derfor hyppigt vil overestimere lag-time. Lag-time vurderes da også til knap 17 timer i de første delforsøg, mens de senere eksperimenter viste en estimeret lag-time på omkring 10 timer. 4.3.1.3 Paclobutrazol Tabel 11. Effekt af kombineret eksponering for methiocarb (0.2mM) eller pirimicarb (0.2mM), samt effekt af tre hjælpestoffer på den dermale penetration og flux af paclobutrazol (0.2mM). Resultaterne på penetration gennem 48 timer og flux er givet som mean + SEM.
PG - Propylenglycol (10mM); SLS - Natrium Lauryl Sulfat (7mM);
Figur 3. Penetration af paclobutrazol (paclo) alene eller i kombination med enten pirimicarb (piri) eller methiocarb (meth). Koncentration af pesticiderne var initielt 0.2mM i donorkammeret. Hvert punkt på kurven repræsenterer gennemsnitsværdien fra 11-17 celler. Den markant forøgede penetration af paclobutrazol over 48 timer ved samtidig eksponering for pirimicarb er primært begrundet i en fordoblet flux (Tabel 11). Resultater fra forsøgene med hjælpestoffer antyder ikke, at disse i sig selv betinger yderligere ændringer af paclobutrazols flux (Tabel 11). Derimod synes hjælpestofferne i relation til paclobutrazol at nedsætte lag-time - i kombinationsforsøgene med paclobutrazol og methiocarb ganske markant. Den nedsatte lag-time og ændrede flux i disse forsøg resulterer da også i en lidt forøget penetration over 48 timer (Tabel 11). 4.4 Konklusion på kombinationsforsøgKombinationsforsøgene med aktivstoffer viser, at de to carbamater ikke i betydende omfang påvirker hinandens penetrationskarakteristika. Paclobutrazol synes heller ikke at påvirke penetration, flux, eller lag-time for de to carbamater, mens begge carbamater påvirker penetrationen af paclobutrazol. Samlet må det konkluderes, at kombinationseffekter eksisterer og kan resultere i såvel øget som nedsat penetration. Denne konklusion er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser med insekticidet diethyl-m-toluamide (DEET), der i nogen studier postuleres at øge penetrationen af andre stoffer (20), medens andre og nyere studier har vist, at DEET nedsætter den dermale absorption af både permethrin og carbaryl (21). De tre anvendte hjælpestoffer synes generelt at nedsætte den samlede penetration over 48 timer, om end effekten er begrænset. De observerede små effekter er betinget af en kombination af en lettere nedsat maksimal flux af de testede pesticider sammen med en til tider svagt nedsat lag-time. De ikke særlig markante effekter af etylenglycol og propylenglycol er i overensstemmelse med forudgående forsøg af dels penetration af enkeltstoffer sammen med hjælpestoffer og dels de indledende undersøgelser, der påpegede disse hjælpestoffers neutralitet over for hudbarrierens integritet. 4.5 Aktivstoffer i salgsformuleringerHovedparten af undersøgelser over pesticiders dermale penetration gennemføres på aktivstofferne alene, og det er ofte disse undersøgelser, der lægges til grund for godkendelser samt anbefalinger vedrørende brug af værnemidler. I den forbindelse er det imidlertid salgsformuleringerne, der er interessante, idet disse består af blandinger af aktivstof og en række additiver/hjælpestoffer. I ovenstående afsnit har vi undersøgt dels effekten af udvalgte og barriereneutrale hjælpestoffers betydning for penetration af 3 aktivstoffer, dels betydningen af blandingseksponering. De tre aktivstoffer anvendes i en række produkter, hvoraf to er udvalgt til videre undersøgelse for hudpenetration i den opstillede in vitro model. Det drejer sig om Mesurol, der er en sneglegift og produceres af Bayer (nu Syngenta) og indeholder aktivstoffet methiocarb, samt PirimorG, der er et insektmiddel og produceres af Zeneca og har aktivstoffet pirimicarb. Begge produkter er testet alene og i kombination med et andet produkt. Undersøgelsesdesign samt metode er identisk med tidligere beskrevne, idet vi dog har lagt et ekstra målepunkt ind efter 12 timer, da vi forudså en muligere hurtigere penetration end aktivstofferne alene. 4.5.1 MesurolMesurol må anvendes til bekæmpelse af snegle i prydplanter og grønsager i væksthuse, og udstrøs som et granulat. Koncentrationen af aktivstof i granulatet er 1 %. Den koncentration, som man udsættes for under arbejde, er selvsagt vanskelig at beregne eksakt, idet koncentrationen vil være maksimal på ydersiden af granulatet og herefter falde med afstanden grundet almindelig fortynding. Produktet anbefales brugt i en mængde af 10 g/m², svarende til 0,1 g aktivstof per kvadratmeter. Med en molvægt på 225,4 gram, svarer det til 44 nmol/cm². Penetrationscellerne i vores forsøgsopstilling har et areal på 2,12 cm², hvorfor den anbefalede mængde svarer til 94 nmol/celle. Med et donorvolumen i hver celle på 600 uL, svarer det til en koncentration i donorkammeret på 0,16 mM. Derfor vurderes en testkoncentration på 0,2 mM, svarende til den der er anvendt for aktivstoffet alene, som relevant. Figur 4. Penetration af Mesurol og dets aktivstof methiocarb. Både Mesurol og methiocarb er appliceret i donorkammeret med en methiocarb-koncentration på 0,2 mM. Datapunkterne repræsenterer et gennemsnit af 9-11 enkeltværdier. Penetrationskurven for Mesurol adskiller sig markant fra aktivstoffet alene (Figur 4). Der er tale om en reduktion af lag-time fra omkring 10 timer for aktivstoffet til kun 2 timer i salgsformuleringen (Tabel 12), ligesom fluxen også er forøget. Samlet resulterer det i en signifikant større penetration over 48 timer. Det er imidlertid ikke denne forskel, der ud fra et praktisk synspunkt er mest interessant. Det er derimod den ganske betydelig kortere lag-time, der betyder, at man under normale arbejdsbetingelser vil risikere absorption af methiocarb langt hurtigere end oprindelig antaget på basis af undersøgelse af aktivstoffet alene. De fundne resultater vurderes at have umiddelbar anvendelse i relation til råd og vejledning omkring hygiejne og anvendelse af handsker ved omgang med dette pesticid. Kombinationsforsøget med PirimorG viser, at en eventuel interaktion mellem de to produkter ikke har nogen indflydelse på penetrationen af methiocarb fra Mesurol (Tabel 12). Denne observation svarer udmærket overens med undersøgelsen af aktivstofferne alene. Tabel 12. Dermal penetration af Mesurol målt som methiocarb samt effekten af kombineret eksponering med PirimorG. Resultaterne på penetration gennem 48 timer og flux er givet som mean + SEM.
4.5.2 PirimorGPirimorG anvendes til bekæmpelse af bladlus i landbrug, gartneri, frugtavl og planteskoler. Koncentration af aktivstof i produktet er 50 %, og det udbringes på gartnerier i en mængde af 150 gram/1000 m², svarende til 75 gram aktivstof per 1000 m². Analog med beregningerne for Mesurol, svarer det med en molvægt for pirimicarb på 238,3 til en koncentration på 31,5 nmol/cm². Med et celleareal på 2,12 cm² og et donorvolumen på 0,6 mL svarer det til 0,11 mM. Derfor vurderes en testkoncentration på 0,2 mM, svarende til den der er anvendt for aktivstoffet alene, som relevant. PirimorG har en lag-time på omkring 2 timer, hvilket er signifikant mindre end aktivstoffets godt 10 timer (Figur 5, Tabel 13). Penetrationshastigheden er derimod rimelig ens for aktivstof og salgsvare, hvorfor der i løbet af 48 timer kun trænger knap 25 % mere aktivstof gennem huden ved anvendelse af salsformuleringen i forhold til det rene aktivstof. Imidlertid gør samme forhold som for Mesurol sig gældene i forhold til relevansen af den stærkt nedsatte lag-time.
Figur 5. Penetration af PirimorG og dets aktivstof pirimicarb. Både PirimorG og pirimicarb er appliceret i donorkammeret i med en pirimicarb-koncentration på 0,2 mM. Datapunkterne repræsenterer gennemsnit af 9-12 enkeltværdier. Hvor PirimorG tilsyneladende ikke påvirker den dermale penetration, flux eller lag-time for methiocarb fra Mesurol, viser kombinationsforsøget, at Mesurol ganske tydeligt ændrer penetrationsforholdene for Pirimicarb. Vi finder således en 40 % øget flux af pirimicarb i kombinationsforsøget (Tabel 11), hvilket resulterer i en samlet penetration over 48 timer, der er øget med knap 30 %. Dette fund er i modsætning til kombinationsforsøget med aktivstofferne alene, hvilket indikerer, at effekten sandsynligvis skyldes de hjælpestoffer, der er til stede i salgsprodukterne, hvor man jo også så en ganske stor ændring mellem methiocarb alene og i salgsformulering. Tabel 13. Dermal penetration af PirimorG samt effekten af kombineret ekponering med Mesurol. Resultaterne på penetration gennem 48 timer og flux er givet som mean + SEM.
* - signifikant forskellige; Students t-test, p<0.05. 4.6 Konklusion på effekt af salgsformuleringerDen betydelige effekt af salgsformuleringerne på penetrationen af aktivstoffer er i overensstemmelse med studier gennemført med atrazine, arachlor og trifluralin, hvor der observeredes en signifikant forøget dermal penetration af de tre pesticider, når de blev administreret i deres salgsformuleringer (22). Den ganske betydelig kortere lag-time observeret for begge pesticider i dette studie betyder, at man under normale arbejdsbetingelser vil risikere absorption af pirimicarb og methiocarb langt hurtigere end oprindelig antaget på basis af undersøgelse af aktivstoffet alene. De fundne resultater vurderes at have umiddelbar anvendelse i relation til råd og vejledning omkring hygiejne og anvendelse af handsker ved omgang med disse pesticider. 4.7 Effekt af dosis på dermal penetrationNærværende undersøgelse er gennemført under anvendelse af samme koncentration af pesticid i alle delstudier, hvilket maksimerer muligheden for sammenligninger mellem forsøg. Forsøgene med salgsformuleringer er således også gennemført ved samme koncentrationer i donorcellerne. Imidlertid er det væsentligt at dokumentere det omfang, som dosis indvirker på de målte penetrations-parametre. Der er derfor gennemført et forsøg med pirimicarb i tre koncentrationer. Tabel 14. Effekt af dosis på dermal penetration, flux, og lag-time for pirimicarb. Resultaterne på penetration gennem 48 timer og flux er givet som mean + SEM.
* - signifikant forskellige; Students t-test, p<0.01. Resultaterne viser, at man ved stigende dosis mindsker lag-time og signifikant øger den maksimale flux. Dette giver samlet set anledning til en signifikant større penetration over observationsperiodens 48 timer (Tabel 14). Diffusionen over den dermale membran anses for at være passiv og følge Ficks lov. Det betyder, at mængden af stof, der penetrerer huden, skal være proportional med gradienten mellem donor og receptor; i tilfældet med uendelig receptor altså proportional med koncentrationen i donor. Resultaterne dokumenterer meget fint denne sammenhæng, idet en 4 eller 10 ganges forøget koncentration i donor resulterer i en henholdsvis 4,2 og 9,8 gange større penetration over 48 timer (Tabel 14). Den eksperimentelle undersøgelse af hudpenetration tager sit afsæt i Fick's lov, der under ideelle forhold foreskriver en ligefremproportionalitet mellem flux og koncentration. I tilfælde med en uendelig donor vil penetrations-koefficienten (Kp) kunne beregnes som forholdet mellem maksimal flux og koncentrationen i donor. Kp skal således være uafhængig af koncentrationen anvendt i et konkret eksperiment. De næsten identiske Kp-værdier (Tabel 14) underbygger således den eksperimentelle metodes validitet. 4.8 Konklusion på dosis-forsøgResultaterne understøtter vores eksperimentelle model og de forudsætninger, som den anvendes under. Endvidere understreger dette eksperiment det væsentlige i, at man ved vurderinger af penetrationsegenskaber for stoffer, der anvendes i arbejdslivet, anvender relevante koncentrationer i eksponeringsforsøg, idet man trods tilnærmelsesvis identiske Kp-værdier kan observere forskelle i lag-time.
|
