|
Undersøgelse for Legionella i drikkevand 3 Forforsøg3.1 Materialer og metoder Fastlæggelsen af den endelige screening blev foretaget på baggrund af et for-forsøg, der havde til formål at undersøge de praktiske forhold ved prøvetagningen samt eventuelle virkninger af modifikationer i forhold til den af Miljøstyrelsen foreskrevne metode (DS 3029, 2001: Miljøundersøgelse – Bestemmelse af legionella – Opkoncentrering og kolonitælling på fast substrat – Overfladeudsæd). Følgende forhold blev undersøgt: Prøvetagning, herunder
Analysemetode, herunder
3.1 Materialer og metoder3.1.1 Vandværker til forforsøgDer blev udvalgt tre vandværker: to private vandværker (Vig Lyng vandværk og Kongepartens vandværk) samt ét kommunalt vandværk (Kongsted vandværk), hvor forforsøget kunne udføres. 3.1.2 PrøvetyperDa der er tale om koldt vand med et forventet lavt indhold af Legionella samt for at opnå et så repræsentativt prøvemateriale som muligt, blev prøvevolumen sat op fra den i DS 3029 anbefalede mængde på 1 liter til hhv. 10, 50 og 100 liter. På hvert vandværk skulle følgende prøver udtages:
3.1.3 PrøvetagningPrøvetagningen af rå- og rentvand blev foretaget med udstyr, der er udviklet af Eurofins Danmark A/S. Med dette udstyr er det muligt at sterilfiltrere den ønskede vandmængde med positivt tryk ude på prøvetagningsstedet. Udstyret (figur 1) består af en filtreringsenhed forbundet til et vandmåleur monteret samlet i en kasse. Inde i filtreringsenheden lægges et sterilfilter (Millipore Cat. No. HAWG047S1) hvorigennem den ønskede vandmængde filtreres og herefter transporteres filteret i en bluecapflaske med sterilt ledningsvand til laboratoriet, hvor analysen for Legionella udføres.
Figur 1 Prøvetagningsudstyret der er udviklet af Eurofins Danmark A/S. Filtreringsenheden er forbundet til et vandmåleur monteret samlet i en kasse. Prøvetagning blev foretaget i henhold til intern prøvetagningsbeskrivelse (se bilag A). Biofilm blev udtaget vha. af svaberpinde og transporteret i en steril stomacherpose til laboratoriet. Filtermateriale blev udtaget med steril ske, flaske eller stomacherpose og transporteret i en steril stomacherpose til laboratoriet. Prøverne blev indleveret på laboratoriet samme dag eller dagen efter de blev udtaget. De blev opbevaret på køl ved 6-11°C under transport og indtil analyse i henhold til ISO 11731. Det var ikke muligt at udtage filtermateriale og biofilm fra Vig Lyng vandværk. 3.1.4 PrøveperiodePrøverne til forforsøget blev udtaget i august 2002. 3.1.5 AnalysemetodePrøverne blev analyseret i henhold til DS 3029 med de modifikationer, at prøvevolumen var større og filtrering af vandet blev foretaget i forbindelse med selve prøvetagningen. Analysen af prøverne blev påbegyndt på laboratoriet inden for to døgn fra prøvetagningen i henhold til ISO 11731. I analysen indgår fire trin:
Ved analysen af vandprøverne blev trin I (vask af filter) og II udført ved modtagelsen af prøverne. Efter henstand af vandprøverne ved stuetemperatur i 48 timer blev på ny udsået: Trin I og trin II blev gentaget og trin III og IV blev udført for at undersøge effekt af prøvehenstand ved stuetemperatur for fund af Legionella hhv. følgeflora. Forventningen ved henstand er, at eventuelle amøber med indhold af Legionella kunne briste og derved frigive bakterierne samt at evt. stressede og ikke dyrkbare Legionella kan restituere. Til analyse af biofilm blev svaberpindene udstrøget direkte på forstøbte plader med GVPC og MWY agar. Efter henstand af svaberpinde i sterilt vand ved stuetemperatur i 48 timer blev de fire trin udført (trin I direkte udsæd af væske uden membranfiltrering). Til analyse af filtermateriale blev trin I udført med det samme. Efter henstand af filtermateriale ved stuetemperatur i 48 timer blev de fire trin udført (trin I direkte udsæd af væske uden membranfiltrering). Se bilag B med flowskema og beskrivelse af metode. Pladerne blev inkuberet ved 37 ± 1°C og aflæst efter 4, 7 og 10 dage. Som en del af den almindelige kvalitetssikring af analysen er der som positiv kontrol anvendt Legionella pneumophila serogruppe 11 til kontrol af at de anvendte substrater er egnede til analysemetoden. I øvrigt testes analysen løbende ved deltagelse i præstationsprøvninger. Da det anvendte prøvevolumen er større end det i DS 3029 foreskrevne prøvevolumen på 1 liter, forventes det at følgefloraen vil kunne dominere og overskygge for evt. forekomst af Legionella. For at vurdere hvorvidt mængden af følgeflora havde betydning for fund af Legionella, blev niveauet derfor aflæst ved at tælle alle fremvoksede kolonier. Desuden blev det vurderet hvor høje kolonital, der kunne accepteres for at det stadig var muligt at skelne Legionella fra øvrige kolonier. I DS 3029 anvendes substratet GVPC (Buffered Charcoal Yeast Extract agar med selektivt supplement), som har stor selektivitet for Legionella og hæmmende effekt overfor eventuel følgeflora. Da MWY-agar (Modified Wadowsky Yee agar) i nogle sammenhænge nævnes som bedre end GVPC til detektion af Legionella blev MWY afprøvet parallelt med GVPC. 3.2 Resultater3.2.1 Effekt af prøvetagningenEn vigtig faktor i filtreringen af vandet viste sig at være de anvendte filtertyper. Det var stort set ikke muligt at filtrere vandet gennem et 0,45 µm filter af cellulose-nitrat, hvilket først blev forsøgt, mens det derimod var muligt at filtrere vandet gennem 0,45 µm filtre af mixed esters af cellulose filtre (nitrocellulose og cellulose acetat). Til filtreringen af 10 l afgangsvand blev der anvendt 1-2 stk. filtre pr. prøve, mens der til filtrering af 50 og 100 l blev anvendt op til hhv. 5 og 10 stk. filtre pr. prøve for at filtrere prøven. Ved udtagning af råvand lukkede membranfiltrene stort set øjeblikkeligt til, fordi råvandet indeholdte for mange partikler til en sterilfiltrering. Løsning med en forfiltrering gennem filter med større porestørrelse viste ikke positiv effekt, idet filtrene stadig lukkede til. Dertil kom at udtagning af råvand ikke var muligt på grund af manglende tryk på råvandet, i de tilfælde, hvor rentvandstanken var fuld. Det blev derfor besluttet at udelukke prøvetagning af råvand i den endelige screening, da de mængder, der ville kunne undersøges, ville være for små til at være relevante. Tidsforbrug til prøvetagning af 10 l afgangsvand var ca. 20 min., ca. 1,5 time for 50 l og ca. 3 timer for 100 l. Af hensyn til tidsforbruget samt en vurdering af, at 10 liter vand kan betragtes som en tilstrækkelig repræsentativ prøve, blev det besluttet at udtage 10 l afgangsvand til den endelige screening. Det viste sig, at vandtrykket gennem vandmåleur ikke var nok til at uret kunne registrere vandmængden. Det blev derfor, til den endelige screening, valgt at anvende en 20 liters dunk til måling af den opsamlede mængde vand. 3.2.2 Betydning af analysemetodeI tabel 1 - 3 ses resultaterne fra vandprøverne fra hver af de tre vandværker i forforsøget. Her er det totale antal kolonier på hhv. MWY og GVPC efter inkubering i 10 dage angivet. Der er ikke påvist Legionella i nogen af prøverne. Den positive kontrol, der er med som kvalitetssikring af analysen, har givet typiske resultater. Tallene for følgefloraen er meget lave, når prøverne analyseres med det samme og følgeflora skønnes derfor ikke at have betydning for analysen. Efter 48 timers henstand ved stuetemperatur viser prøverne høje kimtal og det vurderes, at det er problematisk at påvise Legionella pga. overvækst fra resten af de observerede kim. For at undersøge hvorvidt Legionella ligger gemt under kolonierne på de overvoksede plader, er der lavet et skrab og udstreget fra fem af de overvoksede plader på Blod agar og BCYE-agar. Enkeltliggende kolonier voksede frem med vækst på begge typer agar og det blev vurderet ved aflæsning af pladerne, at ingen kolonier var typiske Legionella. Typiske Legionella kolonier ses på BCYE-agar som konvekse, helrandede, glinsende med kornet overflade (”Knust glas”). De er grå, hvide, blå-violette eller lime-grønne, hvoraf nogle kan fluorescere. Kolonierne er små (pin-point) efter 2 – 3 dage, men vokser derefter til ca. 3 – 4 mm. Ved mikroskopi ses tynde, slanke stave op til filamentøse. Der blev således ikke påvist Legionella ved den umiddelbare analyse af prøverne og ved henstand af prøverne ved stuetemperatur er der heller ikke påvist Legionella. Årsagen til at der ikke påvises Legionella efter henstand, kan enten skyldes, at der reelt ikke er Legionella i prøverne eller at den opvoksende følgeflora undertrykker/overvokser Legionella i selve prøverne. Tabel 1 Vig Lyng Vandværk, vand afgang og råvand. Tallene angiver det totale antal kolonier på hhv. MWY og GVPC efter inkubering i 10 dage – Ingen af kolonierne er Legionella.
*Henviser til trin i metoden,jf. bilag B (samt ovenfor) Tabel 2 Kongsted Vandværk, vand afgang. Tallene angiver det totale antal kolonier på hhv. MWY og GVPC efter inkubering i 10 dage – Ingen af kolonierne er Legionella.
*Henviser til trin i metoden, jf. bilag B (samt ovenfor) Tabel 3 Kongepartens Vandværk, vand afgang. Tallene angiver det totale antal kolonier på hhv. MWY og GVPC efter inkubering i 10 dage– Ingen af kolonierne er Legionella.
*Henviser til trin i metoden, jf. bilag B ( samt ovenfor) I tabel 4 og tabel 5 ses resultaterne fra undersøgelsen af biofilm og filtermateriale fra to vandværker, hvor det var muligt at få adgang til filteret. Der er ikke fundet Legionella i de to prøvetyper fra de undersøgte vandværker. I biofilm-prøven fra Kongsted vandværk er der ikke påvist vækst af bakterier på de anvendte dyrkningsplader. I biofilm fra Kongepartens vandværk er der vækst af bakterier efter henstand af prøven ved stuetemperatur i 48 timer, men i overvokset mængde hvorfor det ikke er hensigtsmæssigt at indføre denne henstandstid. Det samme billede tegner sig for resultaterne af undersøgelsen af filtermaterialet. Det besluttes, at der i den endelige screening udtages biofilm og filtermateriale, hvor det er muligt, og at det analyseres med det samme uden henstandstid. Tabel 4 Kongsted Vandværk, biofilm og filtermateriale. Tallene angiver det totale antal kolonier på hhv. MWY og GVPC efter inkubering i 10 dage – Ingen af kolonierne er Legionella.
*Henviser til trin i metoden, jf. bilag B (samt ovenfor) Tabel 5 Kongepartens Vandværk, biofilm og filtermateriale. Tallene angiver det totale antal kolonier på hhv. MWY og GVPC efter inkubering i 10 dage – Ingen af kolonierne er Legionella.
*Henviser til trin i metoden, jf. bilag B (samt ovenfor) Det er ikke muligt at konkludere entydigt, hvorvidt MWY-agar er bedre egnet til detektion af Legionella end GVPC-agar på baggrund af forforsøget. Da der ikke er fundet Legionella på nogen af de to medier, kan der ikke foretages en sammenligning af kolonimorfologi, altså om typiske Legionella kolonier er nemmere at detektere på det ene medie frem for det andet. Den positive kontrol har opført sig som typiske (konvekse, helrandede, glinsende med kornet overflade (”Knust glas”), grå, hvide, blå-violette eller lime-grønne) Legionella-kolonier på begge typer medier. På MWY-medie ses Legionella med en mere grønlig nuance, men stadig med den karakteristiske glinsende og kornede overflade (”Knust glas”). Endvidere er der ikke nogen entydig tendens i antallet af kimtal fra følgefloraen på de to medier, der kan beskrive en fordel ved at bruge det ene medie frem for det andet. Det er således ikke muligt at vurdere, hvorvidt følgefloraen hæmmes mere på det ene medie frem for det andet. Svaberpindene blev anvendt til at udtage biofilm fra filterinderside. De var fugtige ved modtagelsen i laboratoriet og ved analysestart og det vurderes, at Legionella ville være i stand til overleve på denne måde. Samme metode anvendes generelt til hygiejneprøver og rengøringskontrol, blot hvor de anvendte svaberpinde holdes fugtige i transportmediet, fx Ringer's væske. 3.3 KonklusionDet vurderes, at tidsforbruget til prøvetagning ikke stod i forhold til udbyttet ved de store prøvevolumener (50 og 100 liter). Der blev ikke observeret markant flere mikroorganismer ved de store prøvevolumener i forhold til et prøvevolumen på 10 liter. Som følge deraf blev det vurderet, at der heller ikke er en større sandsynlighed for fund af Legionella ved de store prøvevolumener. Hertil kommer, at mikroorganismer ved filtrering af meget store mængder bliver udsat for et øget fysisk pres. Det blev derfor valgt at anvende prøvetagning af 10 liter afgangsvand. Desuden var det vigtigt at anvende de korrekte filtre, nemlig 0,45 µm filtre af mixed esters af cellulose (nitrocellulose og cellulose acetat). Af disse blev der anvendt 1-2 stk. pr prøve alt efter partikelindhold i vandet, således at filteret ikke stoppede til. Der blev ikke fundet Legionella i prøverne fra de tre vandværker. Det blev vurderet, at følgefloraen ikke var så kraftig, at den gav problemer i forbindelse med aflæsning af pladerne for Legionella. Det ville stadig være muligt at skelne typiske Legionella kolonier fra andre typer bakterier. Det gav ikke nogen positiv effekt at lade prøven henstå ved stuetemperatur i 48 timer, idet mere følgeflora evt. kunne dække for Legionella-kolonier. MWY-agar køres parallelt med GVPC-agar til den endelige screening af rentvand fra vandværkerne, da det ikke var muligt at konkludere éntydigt på baggrund af forforsøget. Endvidere blev det valgt, at de afprøvede modifikationer i forhold til DS 3029:2001 i form af udtagning af biofilm fra kant af filter samt filtermateriale, kunne anvendes til den endelige screening, da det er en kendt metode fra rengørings- og hygiejnekontrol. Samlet konkluderes, at:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
