Miljøprojekt, 994 – Undersøgelse for Legionella i drikkevand

Undersøgelse for Legionella i drikkevand

6 Metoder

6.1 Prøvetagning
6.2 Prøveperiode
6.3 Analysemetode
6.3.1 Vandprøver
6.3.2 Biofilm og filtermateriale

6.1 Prøvetagning

Prøvetagningen fra afgang vandværk og ledningsnettet blev foretaget i henhold til intern prøvetagningsbeskrivelse (se bilag A). Det vil sige efter afspritning og gennemskylning af prøveudstyr, blev 10 liter vand filtreret på prøvetagningsstedet på 10-20 min. Der blev anvendt 1-2 stk 0,45 µm filtre af mixed esters af cellulose (nitrocellulose og cellulose acetat). Prøverne er udtaget som 5 minutters prøver i henhold til DS 2250, hvori det foreskrives, at drikkevand udtages efter, at vandet har løbet med jævn stråle i 5 minutter.

Biofilm blev udtaget vha. af 1-2 stk. sterile svaberpinde og transporteret i en steril stomacherpose til laboratoriet. Et område på ca. 10 cm² blev svabret.

Filtermateriale blev udtaget med steril ske, flaske eller stomacherpose og transporteret til laboratoriet. Der blev udtaget ca. 1 dl filtermateriale fra toppen.

Prøverne blev indleveret på laboratoriet samme dag eller dagen efter de blev udtaget. De blev opbevaret på køl ved 6-11°C under transport og indtil analyse i henhold til ISO 11731.

6.2 Prøveperiode

Prøverne til den endelige screening på vandværkerne blev udtaget efter en lang varm sommerperiode (september til oktober 2002).

Prøverne fra ledningsnettet blev udtaget i en kold vinterperiode (januar 2003).

6.3 Analysemetode

Prøverne blev analyseret i henhold til DS 3029 med de modifikationer, at prøvevolumen var større (10 liter), og at filtrering af vandet blev foretaget i forbindelse med selve prøvetagningen. Analysen af prøverne blev påbegyndt på laboratoriet inden for 2 døgn fra prøvetagningen i henhold til ISO 11731.

Efter nedenstående trin til hver prøvetype blev pladerne inkuberet ved 37 ± 1°C og aflæst efter 4, 7 og 10 dage. Typiske Legionella kolonier ses som konvekse, helrandede, glinsende med kornet overflade (”Knust glas”). De er grå, hvide, blå-violette eller lime-grønne, hvoraf nogle kan fluorescere. Kolonierne er små (pin-point) efter 2 – 3 dage, men vokser derefter til ca. 3 – 4 mm. Ved mikroskopi ses tynde, slanke stave op til filamentøse. Suspekte kolonier blev verificeret ved vækst på BCYE og ingen vækst på BA ved 37 ± 1°C, min. 2 dage.

Detaljeret flowskema og beskrivelse af metode findes i bilag E og bilag F.

I bilag G ses beregningerne til opkoncentreringsgrad, beregningsfaktor og detektionsgrænser.

6.3.1 Vandprøver

Fire trin indgik i analysen af vandprøver

Membranfiltrering (1. opkoncentrering) – er her foretaget i forbindelse med selve prøvetagningen – og vask af filtre
Centrifugering (2. opkoncentrering)
Syrebehandling
Varmebehandling

For ledningsvand indgik yderligere ét trin som en afprøvning:

V. Syrevask af filter og efterfølgende direkte inkubering af filter på agarplade (for at undersøge, om der sidder Legionella tilbage på filtret efter vask).

6.3.2 Biofilm og filtermateriale

Svabere med biofilm blev udstrøget direkte på forstøbte plader med GVPC og MWY agar.

Filtermateriale blev analyseret ved:

0. Direkte udsæd af væske
I. Direkte udsæd af væske efter rystebord/vask
II. Centrifugering (1. opkoncentrering)
III. Syrebehandling
IV. Varmebehandling