|
Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers skæbne i mave-tarm kanalen 1 Indledning1.1 BaggrundBakterien Bacillus thuringiensis (i det følgende kaldet Bt) er den aktive bakterie i mange produkter til biologisk bekæmpelse af insekter. Bakterien anvendes bl.a. til bekæmpelse af malariamyg og i Danmark i plantebeskyttelsesmidler til produktion af bl.a. tomater, agurker og potteplanter. Bakterien indgår i ca. 50 % af sådanne produkter på det danske marked, og udgør ca. 90% af alle produkter til mikrobiel bekæmpelse af skadedyr på verdensplan [Hansen et al., 1996;Hendriksen and Binnerup, 1997]. Desuden er insekticider baseret på nye underarter af Bt med andre anvendelsesmuligheder under konstant udvikling verden over [Feitelson et al., 1992]. Bt er giftig for visse insektlarver, fordi den danner specifikke, insektdræbende toksiner (såkaldte d-endotoksiner eller krystal-toksiner) [Hofte and Whiteley, 1989], som anses for at være uskadelige for mennesker. Bortset fra denne egenskab er Bt ikke til at skelne fra den fødevarebårne sygdomsfremkaldende bakterie Bacillus cereus. Bakterien B. cereus kan give anledning til fødevareforgiftning ved at bakterien indtages i sporeform med maden og efterfølgende spirer og vokser i tyndtarm, hvor der dannes såkaldte enterotoksiner, som kan give diarre [Granum and Lund, 1997]. Det har vist sig at Bt kan danne de samme enterotoksiner som B. cereus, og dette gælder også for de stammer der anvendes i kommercielle plantebeskyttelsesmidler. Da der ved sygdomstilfælde med B. cereus lignende organismer ikke skelnes mellem Bt og B. cereus kan det således ikke udelukkes at en del af de infektioner der tilskrives B. cereus, kan skyldes Bt. Tre enterotoksiner er beskrevet i litteraturen: det hæmolytiske enterotoksin hæmolysin BL (HBL), det ikke-hæmolytiske enterotoxin (NHE) og cytolysin K (CytK). De stammer af Bt, som er undersøgt i projektet, har alle generne for disse toksiner, og for HBL og NHE vides det endvidere at de udtrykkes under laboratorieforhold. Ekspressionen af generne (dvs. produktionen af toksin) kan imidlertid være reguleret af mange faktorer i bakteriernes omgivelser, og man ved ikke, om Bt stammerne danner disse toksiner i tarmen hos dyr og mennesker, eller i givet fald hvor store mængder, de er i stand til at lave. Bakterier i slægten Bacillus danner som et led i deres overlevelsesstrategi sporer, som er inaktive og meget overlevelsesdygtige enheder, der indeholder bakteriens genetiske information, og derudover det minimum af komponenter, som er nødvendigt for at sporen kan spire – dvs. gendanne en ny bakterie. Plantebeskyttelsesmidler der indeholder Bt er baseret på sporer af disse bakterier, der som hovedregel ikke vil spire på plantens overflade, men først udvikle vegetative bakterier i tarmen på de insekter, de skal bekæmpe. Mennesker, der spiser planteafgrøder behandlet med disse midler vil derfor først og fremmest indtage Bt sporer, og ikke vegetative celler. Da det er kendt, at opvarmning inducerer spiring af Bacillus sporer, kan man forestille sig at varmebehandling (under tilberedning) af mad, der indeholder Bt sporer, vil øge sandsynligheden for at sporerne spirer i den humane mave-tarm kanal. Den naturlige tarmflora hos mennesker spiller en vigtig rolle både i beskyttelsen mod infektioner, og i omsætning af næringsstoffer. Det er derfor af stor vigtighed for en sundhedsmæssig risikovurdering at undersøge, om indtagelsen af Bt sporer påvirker sammensætningen af den øvrige tarmflora. En sandsynlig forudsætning for en sådan påvirkning, og en absolut forudsætning for at Bt kan danne enterotoksiner i menneskets tarm er, at sporerne spirer efter indtagelse. Der er imidlertid modstridende opfattelser af, om dette er tilfældet. Nogle studier indikerer, at B. cereus sporer passerer uændrede gennem mave-tarmkanalen hos mus [Spinosa et al., 2000], medens andre viser, at bestemte underarter af B. cereus undergår både spiring og ny sporulering i tarmindhold fra kyllinger og smågrise [Jadamus et al., 2001]. I fremtiden kan man forestille sig en øget eksponering af befolkningen af Bt da 1) der er et øget krav til at reducere brugen af kemiske midler, 2) markedet for økologiske grøntsager, hvor brugen af Bt tilladt i særlige tilfælde (http://www.plantedir.dk/), er i vækst, 3) import af store mængder frugt og grønt produceret i lande hvor Bt produkter anvendes og 4) der er en stigende tendens til at grøntsager konsumeres rå eller kun let tilberedte. Så selvom Bt midler har en ”long history of safe use” kan man forestille sig at den øgede eksponering øger risikoen for en evt. negativ effekt af netop disse midler. Det er derfor nødvendigt at øge opmærksomheden omkring den sundhedsmæssige effekt af Bt baserede insekticider efter oral indtagelse. Vigtige parametre i vurderingen af den sundhedsmæssige effekt af mikroorganismer, som indtages af mennesker, er organismernes evne til at overleve/kolonisere i mave-tarmkanalen, deres evne til at danne sygdomsfremkaldende toksiner i tarmen og deres eventuelle effekt på den øvrige mikrobielle flora i tarmen. I projektet har vi valgt at kigge nærmere på to stammer af Bt, som er tilladte på det danske marked. Bt subsp. kurstaki, som er aktiv overfor insekter af slægten Lepidoptera, og bl.a. anvendes til produktion af væksthusafgrøder såsom tomater, agurker og peberfrugter. Bt subsp. israelensis er virksom overfor insekter af slægten Diptera, og er i Danmark kun tilladt til produktion af potteplanter (http://www.mst.dk). 1.2 Formål med projektetProjektets formål var at eftervise følgende hypoteser, der alle vedrører den sundhedsmæssige effekt ved oral indtagelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler baseret på Bt subsp. israelensis og subsp. kurstaki.
1.3 FremgangsmådeDet er kendetegnende for Bacillus, at der er meget stor variation både mellem arterne, og mellem subspecies (underarter) af den enkelte art. Observationer vedrørende en enkelt underart kan derfor ikke nødvendigvis generaliseres til at gælde for hele arten. De plantebeskyttelsesmidler, der p.t. forhandles på det danske marked er imidlertid baseret på kun to forskellige subspecies af Bacillus thuringiensis. Produkterne VectobacÒ og Bactimos® indeholder Bt subsp. israelensis, medens produktet Dipel® er baseret på Bt subsp. kurstaki. Derfor er det disse to subspecies, vi har valgt at undersøge i projektet. Derudover har vi brugt en B. cereus stamme, der har været årsag til fødevareforgiftning, som ”positiv kontrol” på enterotoksinproduktion. Som model for den humane tarm har vi valgt human-flora-associerede (HFA) rotter, som er så tæt på forholdene i en menneskelig mavetarmkanal som det er muligt at opnå i en dyremodel [Hirayama and Itoh, 2005]. Ved at bruge denne model har vi undersøgt hvad der sker efter dosering med Bt enten indgivet som (i) ubehandlede sporer, (ii) varme-behandlede sporer og (iii) vegetative celler. Derudover har vi anvendt kimfri rotter, dvs. rotter uden tarmflora, til at undersøge spiring, overførsel af DNA og enterotoksinproduktion. Dette er en ”worst-case” model, hvor det er muligt at undersøge enkelte bakterier i højere koncentration end det ofte er tilfældet i en tarm med en etableret tarmflora. 1.4 Rapportens opbygningMateriale- og metodeafsnit indeholder en overordnet gennemgang af de anvendte materialer og metoder. En mere udførlig og teknisk gennemgang af materialer og metoder kan findes i bilag A. Resultatafsnittet består af fire afsnit, som på tværs af de anvendte bakteriestammer giver resultaterne af 1) overlevelse og spiring af stammerne i tarmen hos både HFA og kimfri rotter, 2) effekt på øvrig bakterieflora i tarmen, 3) produktion af enterotoksiner, samt et afsnit om 4) overførsel af DNA fra Bt til andre bakterier i tarmen. Der er blevet udført en del indledende forsøg med optimering af enterotoksin assays. Resultaterne herfra er indgående beskrevet i kapitlet Materialer og Metoder, hvorimod resultater med brug af assayet på bestemte bakteriestammer samt tarmprøver er givet i resultatafsnittet. Ligeledes er selve fremstillingen af en ”grøn” Bt stamme beskrevet i Materialer og Metoder, mens resultater fra dyreforsøget med stammen er refereret i resultatafsnittet. Til rapporten hører bilag A, som udover de førnævnte bilag (materialer og metoder), indeholder mere udførlige data, samt en liste over formidling relateret til projektet og den ene videnskabelige artikel, der indtil videre er publiceret i projektet.
|