| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Forundersøgelser til pilotprojekt om stimuleret reduktiv deklorering

Bilag 13 Mikrobiologisk karakterisering

Dehalococcoides  i vand og sedimentprøver fra Rugårdsvej

Detektion af Dehalococcoides DNA direkte fra jord og vandprøver er en indirekte måde at undersøge, om der findes bakterier der kan foretage nedbrydning af PCE/TCE. Det har nemlig været vist, at under bestemte redoxforhold er nedbrydningen af PCE oftest knyttet til tilstedeværelse af bakterier, der tilhører slægten Dehalococcoides sp. Man anvender altså en slags indirekte tilgang, hvor man i stedet for at detektere nedbrydningsgenerne detekterer den gruppe af organismer, der almindeligvis menes at være dækkende for nedbrydning af PCE.

Dehalococcoides sp. er beslægtede, hvis de bærer nogle særlige gensekvenser i det DNA, der koder for bakteriernes ribosomer. I artiklen Hendrickson (2002) er der angivet 5 forskellige primer sæt som alle angives at være gode for detektion af Dehalococcoides sp. i naturlige prøver. Vi har tidligere i forbindelsen med arbejdet med prøver fra Sortebrovej og Middelfartvej undersøgt de fem primersæt og fundet at det eneste primersæt, der kun detekterede Dehalococcoides sp. var sættet 774-1212.

Vi er fornylig blevet opmærksomme på, at et andet primersæt (1-259) (Duhamel et al., 2004), kunne udgøre et brugbart alternativ til 774-1212, som hele tiden har givet et relativt svagt signal. Vi har vist, at der fremkommer signal med 1-259 med standardrække samt med prøver fra boring M4 men ikke med DNA ekstraheret fra en almindelig landbrugsjord. Da primersættet gav et meget stærkere signal med standardrækken – og alle smeltekurver så lovende ud besluttede vi at køre samtlige modtagne prøver fra Rugårdsvej, samt de gamle DNA prøver fra Sortebrovej og Middelfartvej med i en samtidig kørsel. Denne kan dermed bruges til sammenligning mellem alle prøver.

Vandprøverne er opkoncentreret ved centrifugering af en prøvemængde på 100 ml og sedimentprøverne er her ekstraheret fra 0,5 gram jord. Vi har i tabel 1 angivet DNA kopier pr prøve for alle prøver fremfor at opregne det til ml eller kubikmeter (hvad man nu ønsker). Det bemærkes at der er en god overensstemmelse mellem de to primersæt i de prøver hvor der er et højt niveau af Dehalococcoides sp. Det fremgår endvidere at det er muligt at finde ret få celler pr prøve med anvendelse af det nye primersæt 1-259. Da der ikke blev fundet signal fra en almindelig landbrugsjord og heller ikke i flere prøver fra de gamle lokaliteter (se nedenfor) tyder resultaterne på, at primersættet 1-259 kunne være specifikt overfor Dehalocooides sp. Vi har udtaget flere af de fremkomne DNA-bånd og sendt dem til sekventering for at bekræfte dette. Umiddelbart finder vi høje antal af Dehalococcoides sp. i vandet i forhold til på sedimenterne. Det kunne tyde på at bakterierne er forholdsvis mobile (ikke bundet til sedimentet. Om dette resultat også betyder, at bakterierne vil kunne migrere i sedimentet er uvist. Der er endelig flere Dehalococcoides sp i lerprøverne end i prøverne fra sandlaget.

Tabel 1: Kvantificering af Dehalococcoides i vand og sedimentprøver fra Rugårdsvej. Prøverne er undersøgt ved brug af to forskellige primersæt. Resultatet er angivet som celler pr. prøve. Prøvemængden var 100 ml for vandprøverne og 0,5 g for jordprøverne.

Dehalococcoides i sedimentprøver fra Sortebrovej og Middelfartvej

Vi har kørt prøverne fra Sortebrovej og Middelfartvej med samme detektionssystem som for Rugårdsvej. Indholdet af gener der giver signal med 774-1212 primersættet er stadig under kvantificeringsgrænsen, men en kørsel med primersættet 1-259 giver mulighed for at kvantificere flere prøver (tabel 2). Der er tale om meget lave værdier hvor kvantificeringen er meget usikker under 100 celler/prøve. Bemærk, at der i alle tilfælde som ved de oprindelige Sortebrovej og Middelfartvej rapporter er tale om replikate prøver, der repræsenterer hver sin klump af sedimentprøven. Det giver i nogle tilfælde anledning til stor afvigelse mellem dobbeltprøver.

Tabel 2: Kvantificering af Dehalococcoides i sedimentprøver fra Sortebrovej og Middelfartvej. Prøverne er undersøgt ved brug primersættet 1-259. Resultatet er angivet som celler pr. prøve. Prøvemængden var 0,5 g for sedimentprøverne. Kvantificering er foretaget med standard DNA ekstraheret fra KB1 fortyndet i formationsvand fra boring M4 (Rugårdvej). I alle tilfælde fra Middelfartvej og Sortebrovej var kvantificering med primersættet 774-1212 ikke mulig, idet der var for få celler.

Resultaterne viser, at der er højere antal Dehalococcoides sp i sediment fra Rugårdsvej end fra Sortebrovej og Middelfartvej. Bemærk, at der ikke er analyseret vandprøver fra Sortebrovej eller Middelfartvej. Det var i vandprøverne fra Rugårdvej at de højeste koncentrationer af Dehalococcoides sp. er fundet.

Bemærkninger omkring kvantificering:

Ved ekstraktionen fra sediment/jord/vand fremkommer DNA’et i et volumen på 100 µl og vi anvender normalt 2 µl til den videre PCR analyse pga. risikoen for  matrixeffekter Hvis der ingen matrixeffekter er, kan man bruge 10 µl. I teorien burde man derfor kun kunne få et signal, hvis der er 50 celler pr gram jord (10 celler pr prøve hvis man bruger 10µl). Det fremgår af ovenstående, at vi angiver en lavere værdi og det skyldes at vi har ekstrapoleret ud fra en standardkurve (tilsat KB1 i M4 vand). Da der også er baggrunds signal i M4 på ca. 600 celler pr prøve (100ml) kan vi ikke med stor sikkerhed gå under denne værdi.

Vi har arbejdet med forskellige metoder til fremstilling af standardkurver. Det centrale problem er, at der findes andet end Dehalococcoides sp. i KB1 kulturen. Det har ikke været muligt at opnå bedre estimater for indholdet af Dehalococoides sp. end hvad producenten angiver: ca. 30% af det totale celle antal er Dehallococoides sp.

De ovenstående kvantificeringer med 1-259 er derfor baseret på producentens oplysninger om at der er 30% Dehalococoides sp. i KB1 kulturen.

Referencer

Hendrickson, E. R.; Payne, J. A.; Young, R. M.; Starr, M. G.; Perry, M. P.; Fahnestock, S.; Ellis, D. E.; Ebersole, R. C. Molecular analysis of Dehalococcoides 16S ribosomal DNA from chloroethene-contaminated sites throughout north America and Europe. Applied and Environmental Microbiology. 2002, 68 (2), 485-495.

Duhamel, M., K. Mo, and E. A. Edwards. 2004. Characterization of a highly enriched Dehalococcoides-containing culture that grows on vinyl chloride and trichloroethene. Applied and Environmental Microbiology. 70, 5538-5545.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 Februar 2007, © Miljøstyrelsen.