| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Undersøgelse for patogener i udvalgte vandværker

4 Prøvetagning og analysemetoder

4.1 Prøvetagning

4.1.1 Udtagne prøver

Det har ikke været hensigten at lave en repræsentativ undersøgelse af dansk vandforsyning, men i stedet at søge efter områder med den største forventede risiko for mikrobiel forurening. Dette er grunden til, at der også er analyseret råvandsprøver og ikke kun prøver af færdigtbehandlet drikkevand. Desuden har det været hensigten at få en indikation af, om der var forskel igennem året, om fx perioder med stor infiltration øgede risikoen for forekomst af patogener.

Der blev udtaget prøver fra de 12 valgte vandværker i 4 runder i perioden fra 22. februar 2000 til 16. november 2000. Der blev udtaget vandprøver af blandet råvand i indløb til vandværket samt af det færdigtbehandlede drikkevand. I de tilfælde, hvor der ikke foregik nogen egentlig vandbehandling, blev der kun udtaget en prøve. Fra overfladevandværket blev der udtaget prøver fra søen og fra det færdigtbehandlede overfladevand.

I alt blev der udtaget 35 prøver af råvand fra grundvand, 7 prøver fra ubehandlet overfladevand og 46 drikkevandsprøver. I 9 drikkevandsprøver blev der ikke analyseret for specifikke patogener, da der ikke blev fundet patogener i de tilhørende råvandsprøver.

4.1.2 Prøvetagningsprocedure

Prøvetagningen til de mikrobiologiske analyser fulgte DS 2250/1, idet flaskerne til bakteriologiske prøver forinden var blevet autoklaveret. Prøverne til analyse for protozoer blev udtaget i nye, strålesteriliserede 10 L dunke.

Før udtagning af prøver fra vandværker og boringer blev slange og eventuelle forskruninger fjernet fra prøvehanerne, hvorefter de blev afrenset og flamberet. Herefter løb vandet i mindst 5 minutter, før prøverne blev udtaget fra den frie stråle. Flaskerne blev opbevaret ved 0-5°C i lukkede termokasser, og prøverne til bakteriologisk analyse blev taget i arbejde indenfor 24 timer efter udtagningen. Prøverne til analyse for protozoer blev opbevaret ved 0-5°C i op mod 2 uger før analyserne blev påbegyndt.

Prøverne fra Haraldsted Sø blev i Runde 1 udtaget i ca. 0,5 m dybde ved hjælp af en stang påsat en 1 L steriliseret flaske, hvorfra der blev hældt prøvemængde over i 10 liters dunke til analyserne for protozoer. Ved Runde 2-4 blev de bakteriologiske prøver udtaget ved neddykning af prøveflasken som omtalt ovenfor, mens de to 10 L prøver til analyse for protozoer blev udtaget ved neddykning af selve dunken til ca. 0,5 m dybde.

4.2 Analyser

4.2.1 Udseende, lugt og smag

Subjektive bedømmelser, udført af trænet personale.

4.2.2 Kimtalsbestemmelse

Kimtal v/ 21°C blev bestemt ved dybdeudsæd i King B Agar. Pladerne blev inkuberet ved 21°C i 3 døgn, inden de blev aflæst (DS 2252/1).

Kimtal v/ 37°C blev bestemt ved dybdeudsæd i Plate Count Agar. Pladerne blev inkuberet ved 37°C i 2 døgn, inden de blev aflæst (DS 2254/1).

4.2.3 Coliforme og Termotolerante coliforme bakterier

Antallet af coliforme bakterier blev bestemt ved en MPN-metode (Most Probable Number (DS 2255/1). Prøvemængder på 1 x 50 mL, 5 x 10 mL og 5 x 1 mL blev podet i rør med McConkey Bouillon (dobbelt koncentration til prøvemængderne 50 og 10 mL), hvorefter rørene blev inkuberet ved 37°C og aflæst efter 1 og 2 døgn. Ud fra kombinationen af rør med syre og luft beregnedes MPN-værdien, korrigeret for de undersøgte prøvemængder.

Termotolerante coliforme bakterier blev bestemt ved podning fra rør med både syre og luft i Tryptophanbouillon og McConkey Bouillon, som blev inkuberet i vandbad ved 44°C i 1 døgn, før der blev aflæst for produktion af indol (Kovacs Reagens) i tryptophanbouillon og for syre og luft i McConkey Bouillon. Ud fra kombinationen af oprindelige rør, positive for både indol, syre og luft beregnedes MPN-værdien, korrigeret for de undersøgte prøvemængder.

4.2.4 Campylobacter jejuni / coli

Den anvendte metode er principielt NMKL 119/2 med 10 gange så stor prøvemængde og Preston Bouillon.

Runde 1: Lukkede flasker med 900 mL Preston Bouillon med vækstfremmer (pyruvat, bisulphit og ferrosulfat) og væksthæmmer (antibiotikablanding) blev tilsat 100 mL prøve og inkuberet ved 42°C i 1-2 døgn. Efterfølgende blev der sået ud på overfladen af CCDA (blodfrit, selektivt Campylobacter-medium), som i den foreskrevne mikroaerofile atmosfære inkuberedes ved 42°C i 3-5 døgn, før væksten blev aflæst (analysens trin 1). Der blev udført parallelle analyser med C. jenuni og C. coli til kontrol af metoden.

Runde 2-4: På baggrund af, at C. coli har noget vanskeligt ved at vokse i Preston Bouillon med væksthæmmer, samt at alle prøverne på nær Haraldsted sø måtte forventes kun at indeholde en lille konkurrenceflora, blev Preston Bouillonen ikke tilsat væksthæmmer. Metoden var i øvrigt uændret.

Runde 4: Efter aftale med projektgruppen blev der på udvalgte prøvesteder udtaget parallelle prøver, der blev analyseret for Campylobacter efter den nye metode til bestemmelse af Campylobacter i vand (NN, 2001). Denne metode er semikvantitativ, og er baseret på en opsamling af prøve på 0,45 µm filtre, der overføres til opformeringsbouillon. Afhængigt af det filtrerede volumen kan så angives et interval for koncentrationen Campylobacter jejuni / coli.

4.2.5 Salmonella

100 mL prøve blev membranfiltreret og efterfølgende opformeret ved at overføre filtret til Bufferet Peptonvand ved 37°C i 1 døgn. Herfra overførtes 0,1 ml til Rappaport-Vassiliadis Bouillon, (RV, svarende til den rettede metodeforskrift DS 266/1, Ret. 1) med efterfølgende opformering ved 41,5°C i 1 døgn. Fra RV blev 10 µL udstrøget på overfladen af Brilliantgrønt Laktose Sakkarose Fenolrødt Agar (BLSF), der blev inkuberet ved 37°C i 1 døgn og aflæst for typiske, rødlige kolonier (DS 266/1).

Der udførtes parallelle analyser med Salmonella typhimurium og Salmonella enteritidis til kontrol af metoden.

4.2.6 Cryptosporidium og Giardia

Metoden er nærmere beskrevet andetsteds (Miljøstyrelsen, 2002), men princippet er, at 10 L prøve blev opkoncentreret ved filtrering på et 2,0 µm isopore membranfilter. Filtret blev overført til 150 mL sterilt ionbyttet vand. Opfangede parasitter blev frigjort mekanisk ved omrystning og vandet blev fordelt i 3 centrifugerør. Prøverne blev centrifugeret (Hettich Rotanta) i 10 minutter ved 1500 x g. Supernatanten blev fjernet til 10 mL og de tre prøver blev samlet i et rør, centrifugeret og supernatanten blev fjernet til 10 mL. Herefter blev Giardia cyster og Cryptosporidium oocyster oprenset ved hjælp af immunomagnetisk separation, idet der til 10 mL opkoncentreret prøve blev tilsat buffer, 2 x 100 µL magnetiske granula (Dynabeads) med henholdsvis anti-Cryptosoridium og anti-Giardia. Efter 1 times inkubering under rotation (15-20 rpm) samledes Dynabeads’ne med de vedhæftede cyster / oocyster ved hjælp af en magnet, og supernatanten blev fjernet. Dynabeads blev vasket i buffer og koncentreret igen ved hjælp af den magnetiske partikelkoncentrator. Cyster og oocyster blev frigjort fra Dynabeads ved hjælp af 50 µL 0,1 N HCl og Dynabeads blev samlet ved hjælp af den magnetiske partikelkoncentrator, hvorefter hele prøven (50 µL) blev overført uden Dynabeads til et objektglas, lufttørret og farvet med FITC konjugeret antistof (Meridian Diagnostics, Inc. Italien). Prøven blev mikroskoperet ved 250 x forstørrelse i fluorescensmikroskop, oocyster / cyster blev talt og beregnet pr L prøve.

Proceduren blev ligeledes gennemført med en negativ kontrol bestående af 5 L ionbyttet vand.

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |