Miljøprojekt, 1135 – Påvisning af patogene bakterier i vand ved anvendelse af DNA-chip-prototype og mikrobiologiske dyrkningsmetoder

Påvisning af patogene bakterier i vand ved anvendelse af DNA-chip-prototype og mikrobiologiske dyrkningsmetoder

3 Eksperimentelt design

3.1 Forsøgsplan
3.2 Direkte detektion af patogener i suspensionsprøver
3.3 Detektion af patogener i spikede vandprøver
- 3.3.1 Valg af filtermateriale

3.1 Forsøgsplan

Det eksperimentelle design til undersøgelsen er delt i 2 parallelle blokke, hvor den første del omhandler direkte detektion af patogene bakterier i suspensionsprøver (dvs. uden prøveforberedelse), mens den anden del af forsøget omhandler detektion af patogener spiket i sterilt vand. Prøveforberedelse i form af et membranfiltrerings-trin er inkluderet i analysen af vandprøverne, som skitseret nedenfor.

FORSØGSPLAN

Fremstilling af suspensionsprøver af blanding A, C og A+C

Analyse af prøver vha. DNA-chip
og
mikrobiologiske referencemetoder
(ingen prøveforberedelse)

Fremstilling af spikede vandprøver tilsat blanding A, C og A+C

Analyse af prøver vha. DNA-chip
og
mikrobiologiske referencemetoder
(med prøveforberedelse)

3.2 Direkte detektion af patogener i suspensionsprøver

Først blev hver af de 5 patogene bakterie-isolater podet i et optimalt vækstmedium med henblik på fremstilling af overnatskulturer. Dernæst blev koncentrationen (bakterieceller/ml) af de enkelte overnatskulturer bestemt ved pladespredning/tælling i tællekammer, og suspensionskultur-blandinger af A, C og A+C indeholdende hhv. 10⁸, 10⁶, 10⁴ og 10² bakterieceller af hver af testorganismerne blev fremstillet efter nedenstående skema. Eksempelvis blev der tilsat i alt 10⁶bakterieceller af Campylobacter jejuni, 10⁶ bakterieceller af Aeromonas hydrophila og 10⁶ bakterieceller af Pseudomonas aeruginosa til suspensionsprøve A (10⁶). Indholdet af bakterier i blandingerne A, C og A+C er angivet nedenfor og i afsnit 1.2.

Blanding A):	Campylobacter jejuni + Aeromonas hydrophila + Pseudomonas aeruginosa.
Blanding C):	Campylobacter jejuni + Salmonella spp. + Legionella pneumophila, serotype 1.
Blanding A+C):	Alle.

Suspensionsprøverne blev efterfølgende analyseret efter de mikrobiologiske dyrkningsmetoder beskrevet i afsnit 2. Parallelt hermed blev suspensionsprøverne også analyseret ved anvendelse af DNA-chip-prototypen. De herved opnåede samlede analyseresultater er gennemgået i afsnit 5.

Tabel 3: Oversigt over antallet af suspensionsprøver fremstillet til hhv. mikrobiologisk analyse og DNA-chip-analyse. De mikrobiologiske dyrkningsmetoder kræver flere analyser i de lave koncentrationer, hvorfor der er forskel på antallet af prøver.

Antal celler pr. patogen	Antal suspensionsprøver til mikrobiologisk analyse	Antal suspensionsprøver til DNA-chip-analyse
10⁸	2 A, 2 C, 2 A+C	2 A, 2 C, 2 A+C
10⁶	2 A, 2 C, 2 A+C	2 A, 2 C, 2 A+C
10⁴	8 A, 8 C, 8 A+C	2 A, 2 C, 2 A+C
10²	10 A, 10 C, 10 A+C	2 A, 2 C, 2 A+C

3.3 Detektion af patogener i spikede vandprøver

Spikede vandprøver blev fremstillet ved, at sterilt vand (100 ml) blev spiket med blanding A, C og A+C indeholdende hhv. 10⁸, 10⁶, 10⁴ og 10² bakterieceller for hver af de udvalgte patogene testorganismer (jf. 1.2 og 3.1).

I praksis foregik det ved, at der blev fremstillet endnu 4 ekstra sæt af bakterieblandingerne A, C, og A+C for hver koncentration. Herefter blev bakterieblandingerne fortyndet i sterilt vand til et slutvolumen på 100 ml, som blev filtreret igennem et 0.45 µm filter. Dette prøveforbehandlingstrin resulterede i, at bakterierne blev opsamlet på et filtermateriale, som herefter blev anvendt til analyse med hhv. mikrobiologiske dyrkningsmetoder og DNA-chip-metoden.

3.3.1 Valg af filtermateriale

Til de mikrobiologiske referenceanalyser anvendtes et standard Millipore MF filter, type HAWG (=mixed cellulose acetate og cellulose nitrat, porestørrelse 0.45 µm, filterdiameter 47 mm).

HAWG filtermateriale kan ikke anvendes til DNA-forsøg, fordi denne filtertype har en relativ høj uspecifik bindingskapacitet, idet DNA, protein, cellerester og lignende bindes til filteret. Desuden anvendes detergent (Triton) til fremstilling af filteret, som inhiberer DNA-chip-analysen.

Spikede vandprøver, som skulle analyseres ved hjælp af DNA-chip-prototypen, blev derfor i stedet filtreret igennem et Durapore HVLP filtermateriale (Millipore) med samme porestørrelse og diameter som MF-filtermaterialet til de mikrobiologiske referencemetoder. Durapore-materialet minder i opbygning og egenskaber om et teflon-filter, (dog med 2 i stedet for 4 Fluor-radikaler påsat), og der er ikke brugt detergent under fremstillingsproceduren. Tidligere undersøgelser har vist, at Durapore ikke har nogen signifikant inhiberende effekt på PCR, dvs. det er muligt at anvende Durapore-filtermaterialet direkte i en DNA-analyse (Oyofo og Rollins, 1993. Appl Environ Microbiol. 59(12):4090-5).