Miljøprojekt, 1070 – Risikovurdering af Giardia og Cryptosporidium i vand

Risikovurdering af Giardia og Cryptosporidium i vand

4 Analysemetoder

4.1 Metoder til koncentrering, oprensning og påvisning af Cryptosporidium og Giardia
4.2 Bestemmelse af viabilitet
4.3 Undersøgelse af Cryptosporidium og Giardia i Danmark
4.4 Delkonklusion

Påvisning af protozoer i vand- og miljøprøver er generelt vanskelig, fordi de forekommer i lave koncentrationer og er vanskelige at opkoncentrere. Flere metoder har en lav samt variabel genfindelsesprocent.

Forskellige faktorer herunder vandkvalitet og (oo)cysternes alder påvirker genfindelsesprocenten. Området er genstand for stor forskningsaktivitet og flere nye teknikker er under udvikling. Teknikkerne varierer blandt andet med hensyn til: (1) hvilke vandtyper, der kan analyseres, (2) hvor store mængder, der undersøges, og ikke mindst (3) følsomhed.

Sammenligning af resultater fra forskellige undersøgelser og vurdering af data fra litteraturen kræver derfor et grundlæggende kendskab til de teknikker, der danner baggrund for resultaterne. I det følgende gives en kort oversigt over de mest almindeligt anvendte teknikker. Detaljerne vedrørende de enkelte metoder samt kildehenvisninger findes i bilag B.

4.1 Metoder til koncentrering, oprensning og påvisning af Cryptosporidium og Giardia

Parasitære protozoer forekommer som regel i lave koncentrationer i miljøet, men selv om koncentrationerne er lave, er det alligevel relevant at bestemme koncentrationen på grund af organismernes lave infektiøse dosis og deres robusthed i miljøet. (Oo)cyster befinder sig i sedimentet, bundet til partikulært materiale eller suspenderet i vandfasen. Metoderne til påvisning er baseret på opkoncentrering af (oo)cyster (se tabel 4-1) fra store mængder vand (op til 1.000 L pr. prøve) efterfulgt af forskellige teknikker til separation af organismerne fra prøvematerialet (tabel 4-2), detektion og kvantificering (tabel 4-3). De senere trin omfatter oftest en eller anden form for mikroskopi. Undtagelserne er PCR-teknikker og flow cytometri målinger. Undersøgelse af viabilitet, bestemmelse af infektivitet ved inokulation i mus eller cellekultur samt artsidentifikation ved molekylær typning kræver som regel undersøgelse af dobbeltprøver, idet (oo)cysterne går til grunde og DNA'et destrueres under den kvantitative undersøgelse.

Når en kvantificering afhænger af en forudgående opkoncentrering, er det naturligvis vigtigt at kende effektiviteten og dens usikkerhed. Dette kan for eksempel bestemmes ved at undersøge genfindelsen af et kendt antal tilsatte organismer. Men metoder til at bestemme genfindelsesprocenten for eksempel ved at pode vandprøver varierer mellem laboratorier. Det eksakte antal organismer bør tælles direkte inden podning, eller konfidensintervallerne angives efter gentagen prøvetagning. En anden mulighed er tilførsel af interne standarder (Warnecke et al., 2003). Ofte undlades dette, eller disse data angives ikke i publicerede undersøgelser, hvilket bør tages i betragtning, når data anvendes til risikovurdering.

Tabel 4-1 Opkoncentrering: forskellige filtreringstekniker.

Metode og protozo	Genfindelse	Fordele	Ulemper
Patronfiltrering Giardia Cryptosporidium	Ukendt <1-44%	Forholdsvis enkel metode, relativt billig, kan anvendes til prøver med et højt partikulært indhold.	Lav og variabel sensitivitet, filtrerings-udstyret er primært anvendeligt på vandværker.
Membranfiltrering Giardia Cryptosporidium	40-80% 20-60%	Højere genfindelse end ved patronfil-trering. Baseret på filtrering af 10-40 L, hvilket letter implementeringen.	Dyr metode. Variabel sensitivitet. Ikke velegnet til vand med højt indhold af partikler, idet filtrene tilstoppes.

Flokkulering Giardia Cryptosporidium	30-40% Op til 70% i forsøg, hvor der var tilsat friske (oo)cyster til vandprøverne.	Undersøgelse af volumen op til 10L, simpel teknik, relativ høj genfindelse, billig og anvendelig til vand med høj turbiditet.	Påvirker oocysternes viabilitet.

Tabel 4-2 Separations- og oprensningsmetoder

Metode	Genfindelse	Fordele	Ulemper
Gradient-centrifugering Giardia Cryptosporidium	Op til 90% genfindes ikke.	Billig. Kræver ikke særligt udstyr.	Beskadigede og døde oocyster påvises ikke. Lav genfindelsesprocent.
Immunomagnetisk separation (IMS) Giardia Cryptosporidium	>90% i rene suspensioner	Høj genfindelse i rene prøver. Lette at aflæse, idet indholdet af andre partikler i de oprensede prøver er lavt.	Kommercielt tilgængelige kits er dyre.
Flow cytometri Giardia Cryptosporidium	>90% i rene suspensioner	Som IMS; oprensede prøver er dog ofte renere og tidsforbruget ved aflæsning lavere.	Kræver dyrt og kompliceret specialudstyr samt personale uddannet til håndtering og vedligeholdelse af apparaturet.

Tabel 4-3 Påvisning af Cryptosporidium og Giardia fra koncentrerede vandprøver.

Metode	Genfindelse	Fordele	Ulemper
Immunofluoresens mikroskopi (IF) Giardia Cryptosporidium	Høj. Henstand og forskellige kemiske påvirkninger kan medføre, at (oo-) cysterne ikke farves.	Enkel og forholdsvis billig teknik.	Kommercielt tilgængelige antistoffer er ikke artsspecifikke, men reagerer med alle arter af Cryptosporidium og Giardia.
Polymerase chain reaction (PCR) Giardia Cryptosporidium	Teoretisk: én oocyst, i praksis er genfindelsen som regel lavere.	Høj sensitivitet.	Teknikken er som regel ikke kvantitativ og udtrykker således ikke graden af kontamination i den undersøgte prøve. Risiko for falsk negative resultater pga. inhibitorer i prøverne.

4.2 Bestemmelse af viabilitet

For at kunne vurdere den aktuelle risiko ved at indtage vand med Giardia og Cryptosporidium, er det relevant også at undersøge, hvorvidt påviste protozoer er levende og dermed i stand til at inficere mennesker. Hertil anvendes excystering, vital farvning eller undersøgelse af infektivitet ved podning af mus eller dyrkning i cellekultur. Metoderne kan bruges enkeltvist eller i kombination. Viabilitetsundersøgelser kan vanskeligt kombineres med kvantitative studier og kræver som regel, at der udtages separate prøver til formålet.

4.3 Undersøgelse af Cryptosporidium og Giardia i Danmark

En metode til at påvise Cryptosporidium og Giardia i dansk drikkevand er publiceret (Eldblom et al., 2003). Denne metode anvender en kombination af membranfiltrering, immunomagnetisk separation (IMS) og immunofluoresens antistof detektion (IFA). Lignende teknikker benyttes i USA og UK til lovpligtig undersøgelse af drikkevand for Cryptosporidium og Giardia (Telliard, 2001)

Validering af den danske metode viste en gennemsnitlig genfindelse på hhv. 37-39% for Cryptosporidium og 42-53% for Giardia i forskellige rentvandstyper. Genfindelsen i forskellige typer råvand var 0-3% og 55-62% for hhv. Cryptosporidium og Giardia. Metoden er uegnet til at undersøge råvand, fordi den ikke kan påvise Cryptosporidium oocyster og der tillige er en dårlig farvning af Giardia cyster, hvilket ikke er acceptabelt i prøver med ukendt status. Der er ikke bestemt en nedre detektionsgrænse for metoden, men baseret på en genfindelsesprocent på minimum 25% forventes det, at metoden vil detektere 2-3 (oo)cyster i prøver indeholdende 10 (oo)cyster.

4.4 Delkonklusion

Påvisning af Cryptosporidium og Giardia i vandprøver medfører en lang række spørgsmål, som det er væsentligt at have kendskab til for at kunne evaluere data, der indgår i en risikovurdering. Hvert trin i oprensnings- og detektionsprocessen medfører tab af (oo)cyster, hvorfor genfindelsen generelt er lav og variabel. Kriterierne, for at bedømme hvorvidt en organisme er hhv. Cryptosporidium eller Giardia, varierer fra metode til metode og mellem laboratorier. Desuden påvirkes genfindelsesprocenten bl.a. af vandkvaliteten samt (oo)cysternes alder, hvorfor resultaterne er behæftet med stor usikkerhed og er vanskelige at sammenligne mellem forskellige laboratorier. Det er dog muligt at sammenligne forskellige undersøgelser, da forskellen i koncentration er større mellem forskellige lokaliteter end måleusikkerheden på prøver udtaget på samme lokalitet. Der er derfor ikke taget hensyn til målemetoderne i det videre arbejde. Dette understreger vigtigheden af at finde en standardiseret analysemetode i fremtiden.

I vand- og miljøprøver forekommer der ofte en blanding af forskellige protozoarter og subtyper, der vanskeligt lader sig skelne vha. eksisterende teknikker. Undersøgelser til kvantificering af protozoer i sådanne prøver omfatter sædvanligvis ikke en artsbestemmelse, idet de fleste Cryptosporidium og Giardia arter ikke kan differentieres på baggrund af morfologiske karakteristika. Herudover skelner størstedelen af de publicerede studier ikke mellem levende og døde organismer. Af disse årsager og idet mange arter og subtyper har zoonotisk potentiale, benytter denne risikoanalyse udelukkende betegnelserne Cryptosporidium og Giardia uden yderligere opdeling.