4 Diskussion

Transport af bekæmpelsesmidler over moderkagen, analogier til percutan transport og modellering

Modellering har stigende fokus i regulatoriske sammenhænge. Således tilstræbes fra EU’s side, at (Q)SAR ((Quantitative) structure activity relationships) anvendes i større udstrækning i forbindelse med registrering af kemiske stoffer under EU’s nye kemikalieregulering REACH til at udfylde datahuller. Der er derfor et behov for at udvikle og validere (Q)SAR modeller. I forbindelse med anvendelse af integrerede teststrategier forventes (Q)SAR modeller at komme til at spille en stigende rolle sammen med in vitro systemer (Combes, 2004; Worth, 2004a; Worth, 2004b).

Der er kun en begrænset viden om bekæmpelsesmidlers transport over placenta. Men det er i litteraturen anført, at placentatransport hovedsaglig sker ved passiv transport (Garland, 1998; Audus, 1999; McDonagh, 2007), ligesom transport over huden, dvs. at transporten følger Fick’s lov. Det har endvidere været anført, at de samme parametre som for hudtransport er bestemmende for transporten over placenta, nemlig stoffets molekylvægt, hydrofobicitet/lipofilicitet, pK_a (stoffets ionisation i blodet) og proteinbinding (Bourget, 1995; Pacifici, 1995; Little, 1996; Garland, 1998; Audus, 1999; Garcia-Bournissen, 2003). Der er dog andre mekanismer, som kan influere på placentatransporten for specifikke stoffer, f.eks. lægemidler (Ganapathy, 2000; Gude, 2004; Unadkat, 2004). Lægemidler med molekylevægt større end ca. 500 Da er anført at have nedsat eller ingen transport over placenta, fordi de er for store til at passere porer i placentamembranen (Pacifici, 2005). Da de generelle diffusionsregler øjensynlig gælder for mange stoffer både med hensyn til hudtransport og placentatransport, er det oplagt at undersøge om, det er muligt at opstille en fælles model for hud- og placentatransport.

Ved risikovurdering af kemiske stoffers reproduktionstoksikologiske effekter mangler viden om stoffernes transport over den humane placenta. Der foreligger nogen viden om lægemidlers passage af placenta. I dette studie er transport over placenta og huden undersøgt for 9 kemiske stoffer med henblik på matematisk modellering i forhold til stoffernes fysisk-kemiske egenskaber. Teststofferne blev valgt ud fra et ønske om at dække stor bredde i opløselighed og molekylestørrelse for derved at opnå et repræsentativt datasæt med gode muligheder for modellering.

De testede modelstoffer var caffein, antipyrin, benzoesyre, bisphenol A og de 5 pesticider glyphosat, dimethoat, methiocarb, tebuconazol og miconazol. Heraf forelå der dermale transportdata på stofferne glyphosat, caffein, dimethoat, benzoesyre og methiocarb fra tidligere studier.

For grafisk at sammenligne modelstoffernes passage over henholdsvis hud og placenta er hudpenetrationen (nmol/cm²) og transplacental transport (angivet ved FM-ratioen (C_F/C_M)) illustreret i tabel 4.1, begge som funktion af tiden.

Tabel 4.1. Transport over hud og placenta for de 9 modelstoffer illustreret som hhv. nmol stof/cm² hud og FM ratio (C_F/C_M), der beskriver forholdet mellem stofkoncentrationerne i føtalt og maternelt blod. Forsøgsperioderne var hhv. 48 timer for hudstudierne og 150 min for placentaperfusionsstudierne.

Dermale data	Placenta data
Antipyrin

Antipyrin passerer ikke den dermale barriere, mens stoffet uhindret passerer placenta.
Benzoesyre

Benzoesyre optages meget hurtigt over den dermale barriere og uden lag-time. Transport over placenta går lidt langsommere, men stoffet når over 150 min forsøgsperiode op på samme transport som antipyrin.
Bisphenol A

Bisphenol A transporteres over den dermale barriere, men en betydelig lag-time ses (17 timer). Bisphenol A transporteres også over placenta, men transporten går betydelig langsommere end for f.eks. antipyrin.
Caffein

Caffein optages relativt hurtigt over både hud og placenta. Transporten over placenta ser ud til at gå hurtigere end transporten over huden.
Dimethoat

For dimethoat ses en betydelig lag-time over den dermale barriere før der sker gennembrud. Derimod ses en hurtig transport over placenta. Der var dog stor spredning på placenta-data
Glyphosat

Glyphosat optages i nogen grad over både huden og placenta.
Methiocarb

Methiocarb transporteres over både hud og placenta. Ved transport over huden ses en lag-time på 12 timer. Der er også en svag tendens til en lag-time ved transport over placenta. Methiocarb når op på en høj FM-ratio (højere end antipyrin). Dog er den høje FM ratio > 1 i dette tilfælde ikke udtryk for en stor transport over placenta idet kun en meget lille koncentration af stoffet blev målt på den føtale side. Det formodes derimod at stoffet ophobes i placentavævet.
Miconazol

Miconazol optages ikke over den dermale barriere – dog findes en lille mængde i huden. Miconazol passerer heller ikke over placenta barrieren. Der blev observeret en ophobning af miconazol i placentavævet
Tebuconazol

Tebuconazol transporteres over både hud og placenta. Ved transport over huden ses en lag-time på 14 timer. Der er også en svag tendens til en lag-time ved transport over placenta og transporten over placenta foregår langsomt.

De tidligere unersøgelser af hudtransport har suppleret de data, der er opnået i dette projekt.

Litteraturen beskriver stoffernes logKow som en vigtig faktor for deres transport gennem huden (Cross, 2003). I dette studie observeres en stigende Kρ ved stigende logKow, men kun for stoffer med en logKow mellem -3,5 og ca. 2 (figur 3.3.4). Ved stoffer med en logKow større end 2, så vi ikke denne sammenhæng. For disse stoffer var der en tendens til faldende Kρ ved stigende logKow, men pga. få modelstoffer med en logKow mellem ca. 3 og 5 kan denne tendens ikke præciseres i dette projekt. At den maksimale penetrationsrate findes for stoffer med en logKow omkring 2 er også fundet i andre studier(Cross, 2003; Nielsen, 2008b).

Der blev ikke fundet en klar sammenhæng mellem stoffernes molekylevægt og den målte Kρ. Derimod var der ved stigende molekylevægt en stigende lag-time for passage af huden (figur 3.3.5). Der er en del spredning omkring regressionslinien y = 0,0845x – 6,6483 (r² = 0,45), men to modelstoffer afviger markant fra denne sammenhæng og er ikke medtaget i regressionsudtrykket. Det er antipyrin og miconazol, som ikke passerede huden i løbet af forsøgets varighed (48 timer). Miconazols manglende passage af huden kan forklares med stoffets meget høje lipofilicitet. Antipyrins manglende passage af huden kan ikke umiddelbart forklares. Antipyrin, der anvendes som intern kontrol ved placentaforsøgene, passerer placenta uhindret. Antipyrins fysisk-kemiske karakteristika ligger indenfor det samme interval, som de stoffer, som passerer både hud og placenta. Dog er antipyrin mere vandopløseligt end de øvrige stoffer (51,9 g/L), men kun ca. 2 gange mere vandopløselig end caffein og dimethoat.

Der er en tendens til, at en stigende vandopløselighed medfører en faldende Kρ, men den lineære sammenhæng er meget svag (figur 3.3.8).

I løbet af de 48 timer, som hudforsøgene varer, optages kun et par procent i huden. Der blev observeret en stigende mængde stof deponeret i huden ved stigende molekylevægt (figur 3.3.6). Der opbygges et depot før, stofferne trænger igennem huden og depotets størrelse hænger lineært sammen med molekylevægten, som det kan ses af regressionsudtrykket y = 0,2493x - 36,294 (r² = 0,85). Miconazol falder markant udenfor denne sammenhæng, hvilket kan forklares med stoffets høje lipofilicitet. Der deponeres dog ca. 8 % i huden i løbet af forsøgets varighed (48 timer). Benzosyre afviger også fra denne sammenhæng, formentlig fordi absorptionsprocessen for benzoesyre er afsluttet længe før forsøgsafslutning ved T=48 timer, hvor man måler koncentrationen i huden. For de øvrige modelstoffer var absorptionsprocessen stadig igang ved afslutningen af forsøget. Derfor er det forventeligt, at benzoesyre vil afvige fra de øvrige.

De opnåede resultater for dermal penetration blev testet i to eksisterende matematiske modeller (Berge WF, 2003; Guy, 1993) til beregning af hudpenetration. Modellerne er såkaldte simple modeller til beregning af Kρ. Udregningerne viste at de to modeller begge overestimerer de observerede Kρ-værdier med hhv. 46 % (Potts & Guy) og 35 % (SkinPerm), mens lag-time stærkt underestimeres. Grunden til denne overestimering af Kρ kan skyldes at de eksperimentelle data stammer fra eksperimenter med ’full-thickness’ hud, der vides at resultere i en lavere maksimal fluks og dermed lavere eksperimentelle Kρ-værdier (Nielsen, 2008b).

For 7 af de 9 modelstoffer er der en lineær sammenhæng mellem FM-ratio_150min og logKow (figur 3.3.14), og mellem FM-ratio_150min og log(vandopløselighed). To stoffer falder udenfor denne sammenhæng, nemlig glyphosat og methiocarb. Glyphosats afvigelse fra disse sammenhænge skyldes sandsynligvis glyphosats stærkt hydrofile phosphorsyregruppe, som medfører, at glyphosat er relativt mindre lipofil end de 8 øvrige modelstoffer, jf. nedenfor og figur 4.1. Som det eneste af de 9 modelstoffer har methiocarb en FM-ratio, som er større end 1. En FM-ratio > 1 kan forklares ved, at methiocarb passerer placenta ved en aktiv transport og ikke blot en passiv diffusion (Reynolds, 1990).

For 8 af de 9 modelstoffer er der en lineær sammenhæng mellem den hastighed, hvormed stofferne passerer placenta (IPK) og stoffets lipofilicitet (logKow), jo højere logKow desto lavere permeabilitetskoefficient (IPK). Glyphosat passer dog ikke ind i dette mønster (figur 3.3.15). Hvis glyphosat udelades fra regressionsudtrykket, er der en lineær sammenhæng mellem IPK og logKow med en pæn korrelation (r²=0,95).

På baggrund af disse data ser det ud til, at grænsen for, hvor lav en logKow stofferne kan have og stadig penetrere placenta, er væsentlig lavere end for den dermale barriere. Glyphosat er det modelstof, som har den laveste logKow (-3,2), og det eneste som har logKow, der er væsentlig lavere end 0. Miconazol har en høj logKow og transporteres ikke over placenta.

Den samme sammenhæng eksisterer mellem IPK og log(vandopløselighed), blot medfører stigende vandopløselighed stigende IPK-værdier (figur 3.3.16).

Miconazol er det eneste af de 9 modelstoffer, som ikke passerer placenta. Det forsvinder imidlertid fra den maternelle side af placenta i testsystemet, sandsynligvis fordi det ophobes i placentavævet. Miconazol er det modelstof, som har den højeste molekylevægt (416 Da) og det mest lipofile (logKow = 5,9). Det er anført i litteraturen, at lægemidler med molekylevægt større end 500 Da kun vanskeligt vil passere placenta (Pacifici, 2005). Vore data tyder på, at denne molekylevægtgrænse snarere ligger ved 400 Da.

Figur 4.1. Logaritmen til modelstoffernes vandopløselighed som funktion af logKow. En lineær sammenhæng beskrevet ved y = -1,0672x + 2,0614 (n = 8; r² = 0,9454; glyphosat ikke medtaget) beskriver sammenhængen mellem de to parametre. [Gly: Glyphosat, Caf: Caffein; Ant: Antipyrin; Dim: Dimethoat; Ben: Benzoesyre; Bis: Bisphenol A; Met: Methiocarb; Teb: Tebuconazol; Mic: Miconazol].

Glyphosats afvigelse fra ovennævnte sammenhænge skyldes sandsynligvis glyphosats stærkt hydrofile phosphorsyregruppe, som medfører, at glyphosat er relativt mindre lipofil end de 8 øvrige modelstoffer. Hydrofilicitet (vandopløselighed) og lipofilicitet (logKow) er indbyrdes omvendt afhængige parametre således, at høj vandopløselighed (hydrofilicitet) medfører lav lipofilicitet og omvendt. I figur 4.1 er sammenhængen mellem log(vandopløselighed) afbildet som funktion af logKow for de 9 modelstoffer. De 8 af modelstofferne (glyphosat udeladt) ligger på en ret linie med regressionsudtrykket y = -1,0672x + 2,0614 (n = 8; r² = 0,9454), mens glyphosat afviger fra denne lineære sammenhæng på samme måde som i figur 3.3.15 og figur 3.3.16.

Der er ikke en entydig sammenhæng mellem hudpenetration og placentapassage for de 9 modelstoffer. Når dette er sagt viser resultaterne samtidig også områder, hvor der tydeligt kan ses sammenhænge mellem hudoptagelse og placentatransport af stoffer. For både hud og placenta er vandopløselighed, lipofilicitet, samt størrelse betydende parametre.

For flere af modelstofferne ses en betydelig lag-time ved transport over den dermale barriere (bl.a. dimethoat, bisphenol A, tebuconazol). En sådan lag-time ses ikke i samme grad ved transplacental transport. En kort lag-time kan ses for stofferne bisphenol A, tebuconazol og methiocarb. Dette skyldes formentlig at den passive absorption kan foregå langt hurtigere over en membran som placenta i forhold til den mange-cellede (og fortykkede) hornlag, hvor der kan opbygges et depot afhængigt af stoffernes fysisk-kemiske egenskaber.

Figur 4.2. Lineær sammenhæng mellem IPK og FM-ratio beskrevet ved Y = 0,9897x – 0,0375 (r² = 0,8747). Methiocarb falder udenfor denne sammenhæng og er derfor ikke medtaget i regressionen. [Gly: Glyphosat, Caf: Caffein; Ant: Antipyrin; Dim: Dimethoat; Ben: Benzoesyre; Bis: Bisphenol A; Met: Methiocarb; Teb: Tebuconazol; Mic: Miconazol].

De stoffer, der i dette studie falder udenfor de sammenhænge, der ellers er blevet påvist er bl.a. antipyrin, der anvendes som intern kontrol ved placentaforsøgene. Stoffet optages ikke eller kun ekstremt langsomt gennem huden. I løbet af de 48 timer, som hudforsøgene varer, optages kun et par procent i huden. Der er ikke fundet en forklaring på dette, idet antipyrins fysisk-kemiske karakteristika ikke afviger fra de stoffer, som passerer både hud og placenta om end stoffet dog har en højere vandopløselighed end de andre stoffer (51,9 g/L), dog ikke væsentligt højere end caffein og dimethoat. Et andet stof er miconazol, der hverken optages gennem huden eller passerer placenta, men ophobes langsomt i såvel hud som placentavæv. Benzoesyre opfører sig også specielt, idet stoffet transporteres næsten uhindret over den dermale barriere og opnår ligevægt i løbet af 48 timer. En sammenlignelig hurtig transport over placenta ville derfor være forventelig. Benzoesyre ses dog at have en lavere IPK end forventet i forhold til andre stoffer, som optages hurtigt (figur 4.2).

Sammenhængen mellem data fra placentamodel og hudmodel ses i bl.a. hydrofilicitet af stofferne, men der ses dog ikke umiddelbart nogen sammenhæng mellem de to hastigheder, der beskriver transporten over huden (Kρ) hhv. transporten over placenta (IPK)(figur 4.3).

Figur 4.3. IPK som funktion af logKρ. Da der ikke er målt en Kρ for stofferne antipyrin og miconazol er disse udeladt af plottet. [Gly: Glyphosat, Caf: Caffein; Ant: Antipyrin; Dim: Dimethoat; Ben: Benzoesyre; Bis: Bisphenol A; Met: Methiocarb; Teb: Tebuconazol; Mic: Miconazol].

Undersøgelserne af placentatransport blev gennemført i den treårige projektperiode af forskellige medarbejdere ved KU og en række metodologiske fremskridt er sket undervejs. En mere effektiv rekruttering af donorer af moderkager efter en lang periode med manglende adgang til moderkager er sat i system med dedikeret samarbejde med fødselsafdelingen. Ved anskaffelse af ABL måler (automatisk blodgasmåler fra Radiometer) kan der udføres mere avanceret og sikker overvågning af pH og ilttensioner i væv. Vi har også indført en mere kontinuert overvågning af tab af væske som mål for succes’en af perfusionen, idet vi i et samarbejdsprojekt med Rigshospitalets blodbank har fundet en klar sammenhæng mellem lækage i systemet målt ved IgG overførsel og tab af væske fra den føtale side af cotyledonet til den maternelle. På denne måde har vi bedre kontrol med den enkelte perfusion og kan derfor tidligere i forløbet afgøre om, den er succesfuld. Ofte vil de initiale data fra perfusioner, som senere viser sig at have tabt for megen væske, alligevel kunne bruges, f.eks. til beregning af IPK. Vi har derfor undervejs i projektet udviklet succeskriterier og 2-3 perfusioner er i mange tilfælde tilstrækkelige til at genere brugbare data. Validering af modellen kan ske ved analyser af andre stoffer og/eller analyse af transporten af stofferne i andre modelsystemer. I EU projekterne ReProTect og Nanotest arbejder vi med trophoblastcellelinien BeWo til transportstudier af de samme stoffer og en række andre stoffer. Foreløbige data tyder på korrelation mellem transport i in vitro cellesystemet og ex vivo placentaperfusion.

Forudsætningen for modellering baseret på Ficks lov er proportionalitet mellem påsat koncentration og efterfølgende penetrationshastighed. Den eksperimentelle models validitet i forhold til forudsætningen er tidligere vist i forhold til hudmodellen, og i nærværende studie er opnåelsen af identiske IPK-værdier ved to forskellige koncentrationer af modelstof en styrkelse af også den placentale models validitet (Når man ved to forskellige koncentrationer af modelstof appliceret på donorsiden opnår samme permeabilitetskoefficienter er det udtryk for at Ficks lov holder i vores eksperimentelle set-up, hvilket er forudsætningen for videre anvendelse af data). Baseret på disse to eksperimentelle modeller er en række modelstoffers penetrationsegenskaber undersøgt og sammenholdt med deres fysisk-kemiske karakteristika. Her er fundet en række sammenhænge, men også påpeget en række forskelle og ikke umiddelbart forklarlige observationer for enkeltstoffer forekommer ligeledes. Disse afvigelser mellem modeller og teoretiske forventninger kan naturligvis være betinget af eksperimentelle forhold. Her kan eksempelvis nævnes, at der er anvendt fuldhud i vore studier, medens megen af litteraturen som danner basis for teoretiske modeller har anvendt dermatomhud, der er markant tyndere. Konsekvensen er lavere lag-times og ofte en højere penetrationsrate. Der er faktorer, der taler for og imod begge hudtyper, og OECD anerkender anvendelsen af begge hudtyper, og resultater fra begge typer giver typisk alene kvantitative forskelle. Der er derfor grund til at antage, at størstedelen af de observerede afvigelser fra det forventede har grund i faktorer, der ikke domineres af eksperimentelle forhold. Konsekvensen er derfor en erkendelse af, at ikke alle stoffer opfører sig som forventet, idet man ikke modelmæssigt har medinddraget den faktor, der for et specifikt stof er afgørende. Der vil altid være enkeltstoffer, der afviger fra flertallet, hvilket er en konstant udfordring i ethvert modelleringsarbejde. Reguleringsmæssigt betyder det, at man ved anvendelse af data baseret alene eller overvejende på modelberegninger skal være meget opmærksom på, at specifikke fysisk-kemiske forhold, fx ioniserbare grupper, større funktionelle grupper med deraf følgende steriske karakteristika, kan resultere i klare afvigelser fra det forventede. Der vil i princippet kunne være tale om både over- og underestimerede penetrationshastigheder.