| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste |

Substitution af biocider i bundmaling til skibe med enzymer

6 Øko-toksikologiske undersøgelser

6.1 Testprogram

De øko-toksikologiske test blev udført som GLP studier i overensstemmelse med de nedenfor angivne standarder og guidelines:

• Bionedbrydelighed i havvand /1/
• Væksthæmningstest med den marine mikroalge Skeletonema costatum /2,3/
• Akut toksicitetstest med det ferskvandslevende krebsdyr Daphnia magna /4,5/
• Akut toksicitetstest med den ferskvandslevende fisk Danio rerio /6,7/

6.2 Enzymer

Opløsninger af hver af de tre enzymer AMG 300 L, Alcalase 2,5 L, Type DX samt Pulpzyme®HC blev fremsendt til DHI den 12. november 2001 af BioLocus. Opløsningerne blev opbevaret ved 4°C indtil teststart. Enzymopløsningernes karakteristika fremgår af tabel 6.1.

Tabel 6.1 Enzymer anvendt i økotoksikologiske undersøgelser.

Enzymerne blev testet seperat i test for bionedbrydelighed og akut toksicitet overfor alger, krebsdyr og fisk. En blanding af de tre enzymer blev testet i forholdet 1:1:1 (vægtbasis) for akut toksicitet overfor alger, krebsdyr og fisk.

6.3 Testmetoder

6.3.1 Bionedbrydelighed i havvand

Bionedbrydeligheden af de tre enzymer i havvand blev undersøgt i henhold til OECD Guideline 306 /1/ med den modifikation at der blev anvendt et automatiseret respirometer, hvor iltoptagelsen ved mikrobiel aktivitet kan bestemmes med stor nøjagtighed. Respirometret omfatter 20 individuelle testflasker, hvor ilt og trykforholdene holdes konstant. Mikroorganismerne anvender ilt til at omdanne teststoffernes kulstof til CO₂, som absorberes i en fælde indeholdende KOH. Det resulterende trykfald registreres kontinuerligt og udløser en elektrolytisk dannelse af ilt, som tilføres den enkelte testflaske.

Som inokulum anvendtes naturligt havvand med en salinitet på 32,4‰. Havvandet blev stabiliseret under svag beluftning i ca. en uge inden teststart. Havvandet blev grovfiltreret inden teststart.

Bionedbrydeligheden af hver af de tre enzymer blev testet ved en koncentration 20 mg/l. Testen blev udført i flasker indeholdende 900 ml testopløsning. Respirometret var termostateret til 22°C. Inkuberingen blev udført i mørke over en periode på 28 dage.

For at teste systemets følsomhed blev der tillige udført bionedbrydelighedstest med referencestoffet natriumbenzoat. Som kontrol for eventuel toksicitet af enzymerne blev der udført toksicitetskontrol i flasker inokuleret med både test- og referencestof.

Nedbrydningen af teststoffet beregnes som det biologiske iltforbrug (BOD) i % af det teoretiske iltforbrug ved fuldstændig mineralisering af teststoffet (ThOD):

Det teoretiske iltforbrug blev estimeret ved måling af enzymernes kemiske iltforbrug (COD).

6.3.2 Væksthæmningstest med mikroalgen Skeletonema costatum

Enzymernes toksicitet blev undersøgt i en 72 timers væksthæmningstest med den marine mikroalge Skeletonema costatum (NIVA BAC 1), som holdes i kultur på DHI. Væksthæmningstesten strækker sig over flere generationer af alger og kan derfor betragtes som en kronisk test. Ved undersøgelsen registreres biomassen dagligt i kulturer af alger, der vokser i en fortyndingsserie af teststoffet. Væksttest blev udført på fortyndingsrækker af stamopløsninger (1000 mg/l) af de enkelte enzymer samt på enzymblandingen i vækstmedium ved 28‰ salinintet, pH 8,0 og 19°C. Enzymerne blev testet i følgende koncentrationer: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50 og 100 mg/l.

Væksttest blev udført i 250 ml kolber med 100 ml testopløsning. Algernes vækstrate og biomasse tilvækst blev beregnet på grundlag af daglige målinger af biomassen som in vivo fluorescens. Hæmningen af væksten i kolber med teststof blev beregnet i forhold til kontrolflasker uden teststof og udtrykt som funktion af koncentrationen i prøven. De koncentrationer der hæmmede væksten henholdsvis 10% og 50% blev udtrykt som EC10 og EC50 (hhv. EC10r og EC50r for hæmning af vækstraten og EC10_b og EC50_b for hæmning af biomasse tilvæksten). EC10 og EC50 værdier blev beregnet ved hjælp af statistik programmet TOXEDO /8/. Den højeste testkoncentration uden signifikant effekt (No Observed Effect Concentration, NOEC) samt den laveste koncentration med signifikant effekt (Lowest Observed Effect Concentration) blev beregnet ved hjælp af Dunnett's procedure /9/.

Som kontrol af algernes følsomhed blev der tillige foretaget test for toksiciteten af referencestoffet 3,5-dichlorphenol.

6.3.3 Akut toksicitetstest med krebsdyret Daphnia magna

Enzymernes akutte toksicitet blev undersøgt overfor det ferskvandslevende krebsdyr Daphnia magna. En stamme af Daphnia magna oprindeligt isoleret fra Langedam, Birkerød er blevet holdt i kultur på DHI siden 1979, og dyr fra denne kultur blev anvendt i test. Akuttest blev gennemført på fortyndinger af stamopløsninger af de enkelte enzymer samt enzymblandingen (1000 mg/l). Enzymerne blev testet i følgende koncentrationer: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50 og 100 mg/l.

Akuttest blev udført som en statisk test i 18 ml testglas med 10 ml testopløsning. Akuttest blev udført i mørke ved 20°C. Der blev anvendt 20 dyr for hver koncentration (4 replikater à 5 dyr) og 30 dyr som kontrol. Der blev anvendt dyr der var mindre end 24 timer gamle. Iltindhold og pH blev målt ved start og afslutning af test. Antallet af immobile dyr blev registreret ved teststart, efter 24 timer og efter 48 timer ved testens afslutning.

På baggrund af det registrerede antal immobile dyr efter 48 timer, blev de koncentrationer der forårsagede henholdsvis 10% og 50% immobilisering (EC10 og EC50) beregnet ved Probit analyse /10/.

Ved beregning af EC værdierne skal det verificeres at testkoncentrationerne har været opretholdt på et niveau svarende til mindst 80% af den nominelle koncentration. Alternativt skal EC værdierne baseres på målte koncentrationer. Som kontrol af testkoncentrationerne blev der foretaget analyser af total organisk kulstof (Non Volatile Organic Carbon, NVOC) /11/ i den højest testede koncentration (100 mg/l) til tiden 0, 24 og 48 timer. Udfra NVOC analyserne blev den akutelle testkoncentration estimeret.

Som kontrol af dyrenes følsomhed blev der tillige foretaget test for toksiciteten af referencestoffet kaliumdikromat (K₂Cr₂O₇).

6.3.4 Akut toksicitetstest med zebrafisk (Danio rerio)

Enzymernes akutte toksicitet overfor zebrafisk (Danio rerio) blev bestemt som den akutte dødelighed i en semistatisk test over 96 timer. Akuttest blev gennemført på fortyndinger af stamopløsninger af de enkelte enzymer samt enzymblandingen (1000 mg/l). Enzymerne blev testet i følgende koncentrationer: 1; 3; 10; 30 og 100 mg/l.

Zebrafisk blev indkøbt hos en lokal forhandler og blev efter modtagelsen på DHI akklimatiseret i 12 dage under forhold svarende til testbetingelserne. Under akklimatiseringen blev fiskene fodret dagligt indtil 24 timer før test start. Akuttest blev udført i polyethylen akvarier med 5 liter testopløsning og 10 fisk i hvert akvarium således at 10 dyr blev eksponeret for hver testkoncentration samt kontrol. Testopløsningerne blev fornyet med 24 timers mellemrum for at opretholde testkoncentrationen inden for 80% af den nominelle koncentration. Akuttest blev udført ved 23°C og en lys/mørke cyklus på 14/10 timer.

I løbet af testen blev antallet af døde fisk, svømmeadfærd, pigmentering og respiration registreret hver 24. time. De koncentrationer der forårsagede henholdsvis 10%, 50% og 90% dødelighed (LC10, LC50 og LC90) blev beregnet ved Probit analyse /9/.

Ved beregning af LC værdierne skal det verificeres at testkoncentrationerne har været opretholdt på et niveau svarende til mindst 80% af den nominelle koncentration. Alternativt skal LC værdierne baseres på målte koncentrationer. Som kontrol af testkoncentrationerne blev der foretaget NVOC analyser /11/ af den højest testede koncentration (100 mg/l) til tiden 0 og 24 timer svarende til intervallet mellem hvert vandskift. Udfra NVOC analyserne blev den akutelle testkoncentration estimeret.

Som kontrol af dyrenes følsomhed blev der tillige foretaget test for toksiciteten af referencestoffet kaliumdikromat (K₂Cr₂O₇).

6.4 Testresultater

6.4.1 Bionedbrydelighed i havvand.

Primærdata fra testene fremgår af GLP test rapporterne /12-14/.

Hver af de tre enzymer blev nedbrudt fuldstændigt i havvand i løbet af 28 dage (tabel 6.2). Ingen af enzymerne havde toksiske effekter på bakterierne i havvandet idet iltforbruget i toksicitets kontrollerne var i overensstemmelse med det summerede iltforbrug i flasker med henholdsvis enzymer og referencestof.

Tabel 6.2 Nedbrydning af AMG 300 L, Alcalase 2,5 L, Type DX og Pulpzyme® HC i havvand (OECD 306) i % af det teoretiske iltforbrug.

For både Alcalase 2,5 L, Type DX og Pulpzyme® HC opnås en nedbrydning der overstiger 100% i løbet af testperioden. Dette kan muligvis skyldes at bakteriernes respiration (iltforbrug) blev forøget pga. stress-faktorer som følge af den hurtige fjernelse af kulstofkilder i testflaskerne.

Undersøgelserne opfylder de af OECD opstillede validitetskriterier /1/:

• Resultatet for referencestoffet natriumbenzoat var i overensstemmelse med kriterierne beskrevet i OECD Guideline 306
• Ingen af teststofferne medførte hæmning af mikroorganismerne
• Mulige effekter af nitrifikation af kvælstofholdige komponenter blev taget i betragtning

I henhold til validitetskriterierne må respirationen i kontrolflaskerne ikke overstige 30% af iltforbruget i testflaskerne. Dette validitetskriterie var ikke overholdt i slutningen af de tre testforløb, men var dog overholdt i den periode hvor den overvejende nedbrydning af enzymerne fandt sted (87-100% nedbrydning). At forholdet mellem respiration i kontrolflasker og testflasker ikke opfylder validitetskravet i perioden efter at teststofferne har opnået næsten 100% nedbrydning vurderes ikke at have betydning for resultatet.

6.4.2 Væksthæmningstest med mikroalgen Skeletonema costatum

Primærdata fra testene fremgår af GLP testrapporterne /15-18/.

Alcalase 2,5 L, Type DX samt blandingen af de tre enzymer viste en hæmmende effekt på væksten af alger. AMG 300 L samt Pulpzyme®HC medførte ingen effekter på algevæksten i de testede koncentrationer fra 1-100 mg/l (nominelle koncentrationer), hvorfor EC værdier ikke kunne beregnes for disse enzymopløsninger.

NOEC og EC50 værdier for hæmning af vækstraten som følge af test med de tre enzymer samt blandingen fremgår af tabel 6.3.

Tabel 6.3 Resultater af vækssthæmningstest med Skeletonema costatum (nominelle koncentrationer)

Det fremgår af EC50 værdierne for Alcalase 2,5 L, Type DX og blandingen af de tre enzymer at Alcalase 2,5 L, Type DX var ca. 3 gange mere toksisk end enzymblandingen. Da de tre enzymer hver indgår med 33% i blandingen fremgår det, at blandingens toksicitet alene skyldes toksiciteten af Alcalase 2,5 L, Type DX.

Undersøgelserne opfylder de i metoderne specificerede validitetskriterier /2,3/:

• Celledensiteten i kontrolglassene er forøget med en faktor >16 i løbet af testperioden
• Variationen i pH værdien i kontrolglassene er < 1 fra start til slut

Resultaterne fra testen med referencestoffet 3,5-dichlorphenol viste en EC50 værdi for hæmning af vækstraten på 1,4 (1,3-1,4) mg/l, hvilket er i overensstemmelse med resultater opnået i en international ringtest (EC50 = 1,6±0,3).

6.4.3 Akut toksicitetstest med krebsdyret Daphnia magna

Primærdata fra testene fremgår af GLP test rapporterne /19-22/.

Ingen af de tre enzymer medførte akutte effekter overfor Daphnia magna i de testede koncentrationer fra 1-100 mg/l (nominelle koncentrationer), hvorfor EC værdier ikke kunne beregnes. De estimerede NOEC værdier for de nominelle og målte koncentrationer af enzymerne fremgår af tabel 6.4. De målte koncentrationer blev beregnet på baggrund af NVOC analyser.

Tabel 6.4 Resultater af akuttest med Daphnia magna, baseret på nominelle og aktuelle, estimerede testkoncentrationer.

* Beregnet på baggrund af den gennemsnitlige NVOC værdi i intervallet 0-48 timer

Resultaterne fra testen med referencestoffet kaliumdikromat viste en LC50 værdi på 1,26 (1,12-1,43) mg/l

Undersøgelserne opfylder de i metoderne specificerede validitetskriterier /4,5/:

• Mindre end 10% af kontroldyrene døde under testen
• Koncentrationen af opløst ilt var ved testens afslutning større end 2 mg/l
• Referencestoffets toksicitet ligger inden for det angivne interval på 0,6-2,1 mg/l

6.4.4 Akut toksicitetstest med zebrafisk (Danio rerio)

Primærdata fra testene fremgår af GLP testrapporterne /23-26/.

Ingen af de tre enzymer medførte akutte, letale effekter overfor zebrafisk i de testede koncentrationer fra 1-100 mg/l (nominelle koncentrationer), hvorfor EC værdier ikke kunne beregnes. De estimerede NOEC værdier for de nominelle og målte koncentrationer af enzymerne fremgår af tabel 6.5. De målte koncentrationer blev beregnet på baggrund af NVOC analyser.

Tabel 6.5 Resultater af akuttest zebrafisk (Danio rerio), baseret på nominelle og aktuelle, estimerede testkoncentrationer.

* Beregnet på baggrund af den gennemsnitlige NVOC værdi i intervallet 0-24 timer idet testopløsningerne blev fornyet hver 24. time.

Undersøgelserne opfylder de i metoderne specificerede validitetskriterier:

/6,7/:

• Mindre end 10% af kontroldyrene døde under testen
• Iltmætningen var 60% igennem hele testperioden
• Den gennemsnitlige koncentration af de testede stoffer var >80% af de nominelle koncentrationer i hele testperioden

| Forside | | Indhold | | Forrige | | Næste | | Top |

Version 1.0 April 2004, © Miljøstyrelsen.