|
Kombinationseffekter af pesticider 2 Statistiske metoder til vurdering af kombinationseffekter
Effekter af blandinger af kemikalier evalueres ofte i forhold til en af to referencemodeller: koncentrationsadditionsmodellen eller effektmultiplikationsmodellen. Koncentrationsadditionsmodellen kaldes også Additive Dose Model, og i denne rapport bruges derfor forkortelsen ADM. Effektmultiplikationsmodellen benævnes også den Multiplikative Survival Model, og derfor anvendes forkortelsen MSM (Streibig and Jensen 2000). 2.1 ADM eller MSM?Greco et al (1995) gennemgik i et omfattende review brugen af de to referencemodeller samt en række af metoder, der har været anvendt til at evaluere data i forhold til modellerne (Greco et al.1995). Teoretisk set vil man kunne forvente, at blandinger af stoffer, der har samme virkningsmekanisme, vil følge ADM, hvorimod stoffer, der påvirker forskellige processer i en organisme, vil følge MSM, såfremt der er tale om diskrete responsvariabler. Nyere studier har da også vist, at effekten af blandinger af stoffer med samme virkningsmekanisme kan beskrives tilfredsstillende med ADM (Altenburger et al.2003; ECETOC1993; Faust et al.2001; Junghans et al.2003b; Junghans et al.2003a). Undersøgelserne har imidlertid også vist, at forskellen mellem ADM og MSM sjældent er stor nok til, at man på baggrund af forsøgsdata har kunnet bestemme, hvilken model der beskrev data bedst. Det betyder, at effekten af blandinger af stoffer med forskellige virkningsmekanismer derfor ofte også kan beskrives tilfredsstillende med ADM (Backhaus et al.2004; Backhaus et al.2000; Faust et al.2003; Faust and Scholze2004). Det gælder ikke mindst, når effektestimaterne skal anvendes i en reguleringssammenhæng, hvor der i forvejen anvendes sikkerhedsfaktorer (Faust and Scholze2004). En sammenligning af data fra tokomponent blandinger af herbicider på andemad og alger med de to modeller viste, at forskellen mellem ADM og MSM isobolerne som oftest var for lille til, at man visuelt kunne vurdere, hvilken af de to modeller, der beskrev data bedst. Dette skyldes den forholdsvis lave relativ hældning på enkeltstoffernes dosis-respons kurver. Graden af kurvatur af MSM isobolen afhænger nemlig af den relative hældning på enkeltstoffernes dosis-responskurver (Cedergreen and Streibig2004; Dreschner and Boedeker1995). Der eksisterer derfor et hældningsinterval, hvor de to modeller stort set er sammenfaldende (Figur 1). Dette hældningsinterval ligger for hældningsparametre lidt over1 for den log-logistiske doseringskurve (model 1) (Cedergreen and Streibig2004). Da hældningerne på de enkelte doseringskurver ligger omkring 1-2 for samtlige stoffer testet på andemad og alger (Cedergreen et al.2003), kan dette forklare den lille forskel mellem de to modellers effekt forudsigelser. For de øvrige testsystemer i nærværende projekt gælder det, at hældningen af doseringskurverne for de undersøgte pesticider typisk var signifikant større end 1. MSM modellen for disse kurver ville derfor prediktere en betydelig lavere effekt af en given blanding end en prediktering med ADM modellen. Da ADM modellen derfor er den mest konservative model, altså den model der predikterer den største effekt af en given blanding, er det oftest denne model der bruges som referencemodel i en risikovurderingssammenhæng (ECETOC1993; Faust and Scholze2004; Grimme and Backhaus2003). Vi har derfor valgt at udvikle en statistisk test, der kan teste for signifikante afvigelser fra ADM på EC50 effektniveauet.
Figur 1. MSM isoboler beregnet ud fra kurver på enkeltstofferne A og B, hvor hældningerne var henholdsvis: 0,5 og 0,5 (Sort stiplet kurve), 1 og 1 (Tynd sort kurve), 2 og 2 (Grå tynd kurve) samt 5 og 5 (Grå stiplet kurve). ADM isobolen er vist med en kraftig sort kurve. 2.2 Et-trins modellenForsøgene med tokomponent blandinger i dette projekt er opbygget som et klassisk "stråledesign" (Gessner1995; Greco et al.1995). Dette indebærer, at både enkeltstofferne og tre til fem blandingsforhold testes i forskellige koncentrationer, hvorved man får beskrevet en dosis-respons overflade for den pågældende blanding, som vist i Figur 2. Overfladens form kan beskrives vha. konturplot som svarer til "højdekurve" (Figur 2c), der beskriver topografien i et landskab på et kort. "Højdekurver" på dosis-respons fladen er et udtryk for de kombinationer af de to stoffer, som giver en bestemt effekt. Deres projektion på x-y planet kaldes isoboler (Figur 2d). Traditionelt har man vurderet effekter af tokomponent blandinger enten visuelt, ved at vurdere isobolens form i forhold til ADM isobolen, eller punktvist, ved at forholde en målt effekt med en effekt beregnet vha. referencemodellen (Greco et al.1995). Disse tilgange ignorerer den information, der ligger i data udenfor isobolen eller udenfor det punkt, man er interesseret i. Der er gjort forsøg på at inddrage alle data i en samlet overflademode efter nogenlunde de samme retningslinier beskrevet af Streibig et al. (1998). Ingen andre har valgt at koble overflademodellerne til isobol-konceptet (Greco et al.1995; Haas et al.1996; Haas et al.1997; Haas and Stirling1994; White et al.2004). I forbindelse med dette projekt blev der derfor udviklet en statistisk model, der på baggrund af alle data kunne teste, om 50% effekt isobolen var signifikant forskellig fra ADM isobolen. Lignende modeller vil kunne udvikles for andre effektniveauer som f.eks. EC10, men vi tog udgangspunkt i EC50, da det er det effektniveau, der kan beskrives med mindst usikkerhed. Efterfølgende vil denne model blive kort beskrevet. En mere detaljeret beskrivelse findes hos (Sørensen et al., 2005a). Den statistiske model består af flere trin. I det første trin bliver alle forsøgets doseringskurver beskrevet med en log-logistisk doseringsmodel (Figur 3).
Figur 3. Den log-logistiske dosis-responsmodel, hvor D beskriver kurvens øvre grænse, C beskriver den nedre grænse, ED50 beskriver kurvens placering på x-aksen og B er proportionel med hældningen af kurven i punktet dosis = ED50. Formlen for den log-logistiske model ser ud som følger:
hvor U angiver responsen af det givne test-system, kontrolbehandlingen angiver den øvre grænse (D), mens effekten af de højeste doseringer angiver den nedre grænse (C). Ofte er den nedre grænse lig med nul. Parameteren B angiver hældningen omkring ED50, som angiver den dosering der skal bruges for at halvere væksten 50% mellem de to grænser, D og C. For et forsøg med f.eks. fem blandinger, hver i et faste forhold har vi i alt syv doseringskurver, to for hver pesticid doseret enkeltvis og fem for hver af blandingsforholdene. Det er vigtigt, at blandingsforholdene er valgt, så de fordeler sig jævnt mellem de to enkeltstoffer, således at hele responsoverfladen (Figur 2c) bliver godt beskrevet af data. I første trin af den statistiske analyse bliver alle syv kurver beskrevet simultant i én model. Vi arbejder i dette projekt enten med 3 eller 5 blandingsforhold, hvilket vil sige 5 eller 7 doseringskurver per tokomponentforsøg. I det næste trin bliver data beskrevet med en model tilsvarende model 1, men hvor de relative hældninger, B, formodes at være ens for de 7 kurver. Modellen reduceres altså med 4-6 frihedsgrader afhængig af antallet af blandingsforhold. Denne model sammenlignes nu med model 1 med en F-test baseret på de to modellers residual sum of squares (Bates and Watts1988). Dette gøres for at se, om det er statistisk legitimt at reducere model 1 til en model, hvor doseringskurverne har den samme hældning. Denne tests udføres, fordi isobolerne for en dosis respons overflade, hvor der ikke er signifikant forskel mellem hældningerne på de individuelle doseringskurver, vil være ens uanset effekt niveauet. Det betyder, at hvis der observeres antagonisme på ED50 niveauet, vil der være en tilsvarende antagonisme på ED10 eller ED90 niveauet. Hvis doseringskurvernes hældning ikke er signifikant forskellige, arbejdes der i de efterfølgende analyser videre med en fælles hældning. Ellers fortsættes der med individuelle hældninger for doseringskurverne. I det efterfølgende trin i den statistiske analyse bliver ED50 i model 1 erstattes med en isobolmodel. Vi har valgt at bruge en simpel isobolmodel, der kun indeholder en enkelt parameter til at beskrive isobolens krumning (λ), samt ED50 værdierne fra enkeltstofferne A og B, hvor a og b er doser af stofferne A og B i blandinger, der giver en samlet effekt på 50% (Hewlett1969)(Figur 4)
Når λ er lig med 1 følger isobolen ADM (Figur 4, sort fuldt optrukken kurve). Når λ er større end 1 er effekten af blandingen større end forventet ud fra ADM, og isobolen ligger indenfor ADM isobolen (Figur 4, grå kurve). En sådan respons defineres her som synergistisk. Er værdien af λ mindre end 1, har man en mindre end additiv respons, hvilket vi her har valgt at kalde en antagonistisk respons. Ved at erstatte de 5-7 frit varierende ED50 værdier med en 3-parameter isobolmodel reduceres den samlede model med yderligere 2-4 frihedsgrader. Model 1 eller eventuelt den forenklede model med ens hældning for samtlige doseringskurver, sammenlignes med model 2 med den samme F-test baseret på de to modellers residual sum of squares, for at se om det er statistisk forsvarligt at reducere modellerne med frit varierende ED50 værdier til model 2, der fikserer ED50 værdierne langs en veldefineret isobol. Hvis isobolmodellen bliver afvist, må man forholde sig til om det skyldes stor variation mellem de enkelte kurver, f.eks. at én af de 5 til 7 doseringskurver er dårlig beskrevet, eller om den manglende accept
Figur 4. Isobolmodellen beskrevet af Hewlett (1969) kan kun beskrive isoboler, der ligger indenfor det markerede kvadrat afgrænset af 1. Vi kan antage at figuren viser isoboler på ED50 niveauet. Den fuldt optrukne sorte kurve beskriver ADM isobolen, den grå kurve viser et eksempel på synergisme, mens den stiplede kurve viser et eksempel på antagonisme, beskrevet med Hewletts model. Antagonisme der ligger udenfor begrænsningerne på Hewletts model, kan beskrives med Vølunds model (Vølund, 1992). skyldes, at isobolmodellen ikke formår at beskrive data. Hvis konklusionen er, at det skyldes meget variable data, kan man beslutte at fortsætte, med det forbehold at man ved, at ens data ikke opfører sig ideelt. Alternativt kan man vælge at anvende en model, der tager højde for, at der kan være ekstra variation imellem doseringskurverne, som er uafhængig af den variation, der findes mellem fortyndingerne indenfor den samme kurve. Denne ekstra variation kan f.eks. være opstået under blandingen af de to kemikalier, eller fordi de enkelte forsøg er kørt tidsmæssigt forskudt. Med udgangspunkt i estimatet for λ er det muligt at kvantificere afvigelser fra ADM, idet man ved hjælp af udtrykket 21- λ kan beregne, hvor meget doseringen af en 50:50 blanding skal ændres for at fastholde effekten (Sørensen et al. 2005a). Eksempelvis er det i tilfælde af antagonisme nødvendigt at øge doseringen af de to pesticider med 19%, hvis λ er 0.75 (21-0.75=1.19), mens doseringen af pesticiderne kan halveres i tilfælde af synergi, hvis λ er 2 (21-2=0.5). Det er også muligt ved hjælp af λ at kvantificere afvigelser for andre blandingsforhold end 50:50 blandingen, men dette er mere kompliceret at beregne. Endvidere er 50:50 blandingen den blanding, hvor afvigelsen fra ADM er maksimal i tilfælde af, at λ er signifikant forskellig fra 1. Hvis den manglende accept af isobolmodellen skyldes, at modellen ikke formår at beskrive data, kan man anvende en anden isobolmodel (Se nedenfor). Ellers køres der nu en fjerde test, hvor isobolmodellen, der tillader synergisme og antagonisme, erstattes med ADM isobolen. Dette svarer til at sætte λ lig med 1 i model 2. Denne model sammenlignes med model 2 med en F-test efter samme principper som før. Hvis F-testen ikke er signifikant, er isobolen ikke signifikant forskellig fra ADM isobolen. . Det skal understreges, at ADM isobolen estimeres på baggrund af alle data. Det vil sige, at den rette isobol ikke nødvendigvis skærer i gennemsnittet for ED50 for de to enkeltstoffer, da også usikkerheden på bestemmelsen af disse tages med i beregningerne (se f.eks. Figur 7). Dette er modsat af den praksis man ofte ser, når afvigelser fra ADM vurderes visuelt eller punkt for punkt (Altenburger et al. 1990;Christensen et al. 2001). I disse tilfælde trækkes ADM isobolen mellem gennemsnittene på enkeltstofferne. Vi mener, det er mest korrekt også at inddrage den usikkerhed, der uvægerligt er på bestemmelsen af ED50 for enkeltstofferne indenfor det enkelte forsøg. Hvis det ikke gøres, vil en enkelt f.eks meget høj ED50 for et enkeltstof kunne føre til, at blandingen blev kategoriseret som synergistisk, selvom de resterende 6 kurver lå på ADM-isobolen. Når man inkluderer variationen på enkeltstofferne minimeres risikoen for at begå sådanne fejl. Den anvendte isobolmodel (model 2) har nogle begrænsninger, idet den ikke kan beskrive asymmetriske isoboler, eller stærkt antagonistiske isoboler, der ligger udenfor området defineret af ED50A og ED50B (Figur 4). Da nogle af de undersøgte tokomponent blandingerne udviste meget stærk antagonisme blev en alternativ isobolmodel inkorporeret i det statistiske program. Denne model er beskrevet af Vølund (Vølund 1992) og brugt af Streibig et al. (1998):
I denne model beskriver parametrene η1 og η2 krumningen på isobolen og a og b er stadig de koncentrationer af pesticiderne A og B, som samlet i blandingen giver en 50% effekt. Når krumningsparametrene η1 og η2 begge er 1, beskrives ADM isobolen. Hvis η1 og η2 begge er mindre end 1, er responsen synergistisk og hvis η1 og η2 begge er større end 1 er der antagonisme. Hvis parametrene er forskellige, bliver isobolen asymmetrisk. Beskriver denne isobolmodel data tilfredsstillende, testes der ikke for afvigelse fra koncentrationsaddition, da en velbeskrevet, meget antagonistisk isobol klart vil være signifikant forskellig fra ADM isobolen. Et-trins modellen er udviklet på baggrund af data fra akvatiske planter og alger, som opfylder betingelserne om, at alle enheder er testet samlet, og kun anvendt til analyse af resultaterne fra disse testsystemer. For blandingsforsøg, hvor man af praktiske årsager har været nødsaget til at splitte det samlede forsøgsdesign op, er to-trins modellen mere korrekt at bruge. 2.3 To-trins modellenTo-trins modellen tager højde for den situation, hvor der er ekstra variation mellem kurverne, som er uafhængig af den variation, der findes mellem fortyndingerne indenfor den samme doseringskurve. I denne model beskriver man i trin I doseringskurverne enkeltvis med en log-logistisk dosis-respons (model. 1). Det betyder, at til forskel fra et-trins modellen kræver to-trins modellen ikke, at doseringskurverne estimeres simultant. I trin II bliver fordelingen af EDx'erne beskrevet med Hewlett’s isobolmodel (model 2), hvor der tages højde for størrelsen af variationen på de enkelte EDxestimater (Sørensen et al., 2005b). Fordelen ved at anvende denne model er, at man kan få et udtryk for størrelsen af den ekstra variation der findes mellem forsøgene. Altså et udtryk for hvor godt eller dårligt data er beskrevet med en ideel isobolmodel. Ulempen er, at man ikke anvender alle data samlet, og at noget af informationen i det samlede datasæt går tabt mellem trin I og trin II. Denne model er derfor også betydelig mere konservativ end et-trins modellen, da testen for additivitet som følge af den reducerede mængde information, som indgår i testen, ikke har samme styrke. Af samme grund kan der heller ikke findes en eksakt p-værdi for, om isobolen er forskellig fra den additive model, men der opgives i stedet et p-interval. Den lave værdi i p-intervallet svarer til, at man antager at der ikke er nogen ekstra variation mellem kurverne, mens den høje p-værdi svarer til, at der er en ekstra variation mellem kurverne. Af samme årsag ligger den lave p-værdi for to-trins modellen ofte tæt op ad den p-værdi der opnås ved brug af et-trins modellen, når samme data testes i begge modeller (Sørensen et al., 2005b). I nærværende projekt er to-trins modellen anvendt til at analysere resultaterne med terrestriske planter, akvatiske bakterier, dafnier samt hormonforstyrrende effekter. Det betyder, at for disse testsystemer var det ikke muligt at anvende Vølunds model (model 3) for de blandinger, som udviste store eller asymmetriske afvigelser fra ADM . Både et- og to-trins modellen er programmeret i statistikprogrammet R (R Development Core Team²004). Modellerne er udviklet med afsæt i data på akvatiske planter og alger, men kan også anvendes på sigmoide kurver, der estimerer effekt og ikke respons, sådan som det er tilfældet i celleassayene. 2.4 Andre metoderDer findes et væld af andre metoder til at evaluerer effekten af blandinger. De fleste er meget reduktionistiske i forhold til de her beskrevne metoder (Altenburger et al., 2003; Greco et al., 1995). En af metoderne er, at se på effekten af blandinger, der følger en ADM-isobol. Det svare til at se på lodrette tværsnit af dosis-respons overfladen som følger forskellige pre-definerede ADM-isoboler (Figur 5). Metoden er brugt i situationer, hvor man er interesseret i, om man kan erstatte en bestemt dosis af et produkt, med en ækvipotent dosis af et andet produkt. Metoden kræver et betydeligt mindre forsøgsdesign, da det kun er et enkelt potentielt effekt-niveau, der undersøges.
Figur 5. Vækstraten af Lemna minor ved ekvipotente blandinger af MCPA og mechlorprop samt ved ekvipotente blandinger af Acifluorfen of Mesotrion på koncentrations-niveauer, der svarer til EC50 (den maksimale vækstrate er ca. 0,30 d-1). Blandingen af MCPA og Mechlorprop er additiv (Appendix 3), hvorimod blandingen af acifluorfen og mesotrion er antagonistisk (Appendix 3), når blandingerne evalueres med isobol-metoden. En tilsvarende trend kan observeres i de viste figurer. Denne måde af afbillede blandinger svarer til, at man lægger et vertikalt snit ind i dosis-respons overfladen (Figur 2c) langs ED 50 ADM-isobolen, modsat isobol metoden, hvor vi evaluere responsoverfladen ud fra vertikale snit/projektioner (isoboler). Metoden bruges i sammenhænge, hvor man af praktiske grunde er nød til at arbejde med reducerede forsøgsdesign. 2.5 Trekomponent blandingerEffekten af trekomponent blandingerne blev evalueret visuelt vha. en figur, hvor ADM isobolplanet er indtegnet. Der findes ikke metoder til at evaluere trekomponent-blandinger statistisk, og en udvikling af sådanne metoder ligger udenfor det nærværende projekts formål. En visuel vurdering giver dog en stærk indikation af, om resultaterne af trekomponent blandingerne afviger markant fra det forventede. De binære blandinger, som indgik i forsøgene med trekomponent blandinger, blev evalueret med enten et- eller to-trins modellen.
|
