Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 98 – Kombinationseffekter af pesticider

Kombinationseffekter af pesticider

Sammendrag af litteraturstudium

Referencemodeller

Det er veldokumenteret, at ved samtidig eksponering af mennesker, dyr eller planter for to eller flere kemiske stoffer kan kemiske stoffer påvirke hinandens effekt. At undersøge og beskrive kombinationseffekter af kemiske stoffer har derfor været emnet for mange studier inden for bl.a. farmakologien og toksikologien, hvor samtidig eksponering til flere stoffer er et almindeligt forekommende fænomen. Kombinationseffekter af pesticider er blevet studeret både med henblik på at beskrive de ønskede effekter af pesticiderne på ukrudt, patogene svampe og skadedyr samt de uønskede øko- og humantoksikologiske effekter.

På trods af den store interesse for at undersøge kombinationseffekter er der ingen konsensus om hverken terminologien eller referencemodel. Mens den manglende konsensus om terminologien blot resulterer i en vis forvirring, når resultater fra forskellige undersøgelser sammenholdes, så er den manglende konsensus om valg af referencemodel en væsentlig hindring for at kunne sammenstille resultater fra forskellige studier, idet forskellige referencemodeller ofte betyder, at der også er anvendt forskellige forsøgsdesign.

I forbindelse med nærværende projekt er der gennemført et litteraturstudium, som havde til formål 1) at præsentere og diskutere de mest anvendte referencemodeller bl.a. med henblik på at fastlægge hvilke(n) model, der skulle anvendes i projektet, samt 2) at sammenstille den tilgængelige litteratur vedrørende kombinationseffekter af pesticider. Litteraturstudiet er – som projektet - begrænset til økotoksikologiske studier på akvatiske og terrestriske non-target organismer samt humantoksikologiske studier med kemiske stoffer med østrogene og antiandrogene effekter. For yderligere information om de toksikologiske effekter af pesticidblandinger henvises til et litteraturstudium udarbejdet ved Danmarks Fødevareforskning i 2003.

Referencemodeller

Forskellige referencemodeller har været anvendt i litteraturen. Modellerne er grundlæggende baseret på en antagelse om, at enten kan kemiske stoffer erstatte hinanden med udgangspunkt i deres relative styrke analogt til veksling af valutaer, eller også virker de kemiske stoffer uafhængigt af hinanden. Den førstnævnte gruppe af modeller betegnes "Concentration Addition" eller "Additive Dose Model (ADM)". Den sidstnævnte gruppe af modeller betegnes "Independent Action", "Effect Multiplication" eller "Multiplikative Survival Model (MSM)". En tredje model er "Effect Summation", men denne model har næsten ingen anvendelse haft i biologiske studier.

MSM blev udviklet til kvalitative responsvariable som f.eks. død/levende, dvs. minimum- og maksimumværdierne vil altid være 0 og 1 eller 0 og 100%, hvis resultaterne udtrykkes procent effekt i forhold til kontrollen. For at MSM kan anvendes på kvantitative data, er det nødvendigt at estimere det maksimale respons på grundlag af de eksperimentelle data. En vigtig men ofte overset forudsætning for at kunne anvende MSM er, at doseringskurverne for de enkelte kemiske stoffer følger "Effect Multiplication" reglerne, hvilket er tilfældet for eksponentielle doseringskurver men ikke for de ofte anvendte log-logistiske doseringskurver. I modsætning til MSM så er ADM uafhængig af doseringskurvernes form, og følgelig vurderes ADM af mange som værende en konceptuel bedre referencemodel. Der er imidlertid kun konsensus om at anvende ADM for blandinger af kemiske stoffer med samme virkningsmekanisme, mens MSM har været den foretrukne model for blandinger af kemiske stoffer med forskellige virkningsmekanismer. Hvad der forstås ved samme virkningsmekanisme, er der imidlertid ikke enighed om. Er det tilstrækkeligt, at f.eks. to pesticider påvirker den samme fysiologiske proces, eller skal effekten være identisk på molekylært eller biokemisk niveau?

Litteraturstudiet viste, at antallet af publikationer omhandlende kombinationseffekter af kemiske stoffer, hvor minimum et af stofferne er et pesticid, var forholdsvis begrænset. Det blev derfor besluttet også at inddrage studier med andre organiske forbindelser end pesticider, idet de teoretiske overvejelser, der har ligget til grund for f.eks. valg af forsøgsdesign og referencemodel er identiske med de overvejelser, der er relevante i forbindelse med kombinationsforsøg med pesticider. Et af formålene med litteraturstudiet var at belyse anvendelse af ADM og MSM i kombinationsforsøg, og derfor er der kun medtaget studier, hvor valg af referencemodel er entydigt defineret.

Økotoksikologiske undersøgelser

Økotoksikologiske undersøgelser med kombinationer af organiske forbindelser er karakteriseret ved, at de har inkluderet et meget stort antal stoffer, men som regel er effekten af blandinger kun undersøgt ved et enkelt effektniveau, typisk EC₅₀. Med hensyn til de anvendte statistiske metoder grupperer undersøgelserne sig i to grupper. Enten er der anvendt Toxic Unit (TU) eller Additive Index (AI), som er en reparametrisering af TU. Begge koncepter er simplificerede versioner af ADM, hvor det ikke er nødvendigt at kende doseringskurverne for de enkelte stoffer men blot sammenhængen mellem dosering og effekt ved et enkelt effektniveau. Additivitet er karakteriseret ved at summen af TU'erne i en blanding ved et givet effektniveau er 1. TU blev oprindeligt udviklet for blandinger, hvor stofferne i en blanding undersøgtes ved ækvitoksiske doseringer, dvs. doseringer der resulterer i samme effekt. Senere er TU dog også anvendt for blandinger bestående af ikke-ækvitoksiske doseringer. TU konceptet er senere udvidet med en såkaldt "similarity parameter", som angiver afvigelser fra additivitet.

Det andet koncept, der er anvendt, er Könemanns Mixture Toxicity Index (MTI). En MTI værdi på 1 indikerer additivitet, som defineret med ADM, mens en værdi på 0 indikerer "no addition", som er et specialtilfælde af MSM, hvor det individ i en population, som er mest følsom over for ét stof også er mest følsom over for alle de øvrige stoffer i blandingen. I de fleste tilfælde, hvor MSM er anvendt, har man valgt at antage, at der ingen korrelation er mellem individernes følsomhed over for de enkelte stoffer, og er det tilfældet vil MTI antage en værdi imellem 0 og 1. Könemann definerer dette som partiel additivitet, mens antagonisme og synergisme optræder, når MTI er henholdsvis lavere end 0 eller højere end 1.

Som oftest kendes organiske stoffers virkningsmekanisme på non-target organismer ikke, men typisk opdeles stofferne i fire grupper: "inert compounds", "less inert compounds", "reactive compounds" og "specifically acting chemicals". På trods af denne opdeling er det vanskeligt, med baggrund i de gennemførte undersøgelser, at drage nogen konklusioner vedrørende sammenhængen mellem blandingers respons og de enkelte komponenters virkemåde.

Sammenfattende kan det konkluderes, at blandinger af stoffer med formodet samme virkningsmekanisme i de fleste tilfælde fulgte ADM, mens effekten af blandinger af stoffer med formodede forskellige virkningsmekanismer som oftest har været mindre-end-additiv, dvs. TU<1 eller 0<MTI<1. Disse blandinger har altså i teorien kunnet være overensstemmelse med MSM, men dette er i de fleste undersøgelser ikke forsøgt verificeret. Synergi, dvs. TU og MTI værdier højere end 1, er kun observeret i meget få tilfælde. I flere af undersøgelserne har forfatterne da også konkluderet, at ADM synes at kunne anvendes som en "worst-case" refererencemodel.

På trods af det forholdsvis store omfang af kombinationsforsøg med organiske forbindelser, er undersøgelserne behæftet med en række usikkerheder. I hovedparten af forsøgene kendes sammenhængen mellem dosering og effekt ikke men blot EC₅₀ værdierne. Ækvitoksiske blandinger af f.eks. en blanding bestående af 10 stoffer er fremstillet ved tilsætte 1/10 af EC₅₀ doseringen af hvert stof. Kun hvis de 10 stoffer har identiske doseringskurver, som kun varierer i deres placering langs doseringsaksen, vil der være tale om ækvitoksiske doseringer. Er doseringskurvernes form forskellige, vil der ikke være tale om ækvitoksiske blandinger. En anden usikkerhedsfaktor i flere af undersøgelserne er, at aktiviteten af mange af stofferne ikke er bestemt eksperimentelt men derimod vha. Quantitative Structure Activity Relationship (QSAR), hvor aktiviteten predikteres med udgangspunkt i den kendte aktivitet af stoffer med lignende kemisk struktur.

Antallet af publikationer, der beskriver økotoksikologisk relaterede undersøgelser med pesticidkombinationer, er meget begrænset sammenlignet med antallet af studier, der har undersøgt de agronomiske perspektiver ved anvendelse af pesticidblandinger.

Forsøg med binære blandinger af pesticider har vist, at disse blandinger alt overvejende har fulgt ADM. Afvigelser fra ADM har været i form af mindre-end-additive effekter, mens synergi i form af mere-end-additive effekter kun er observeret i meget få tilfælde. En sammenstilling af resultater fra en række forskellige undersøgelser med binære blandinger af pesticider udført med algen Scenedesmus vacuolatus som testorganisme viste, at forholdet mellem de predikterede og observerede EC₅₀ værdier var tæt på 1, når ADM var anvendt som referencemodel, mens forholdet var signifikant højere end 1, når MSM var anvendt som referencemodel. Altså undervurderes effekten af blandingerne med MSM.

Indenfor de senest 3-4 år er der udført en række meget detaljerede og veltilrettelagte undersøgelser med multikomponent blandinger af pesticider af to forskergrupper ved universiteterne i henholdsvis Bremen og Leipzig. Formålet med disse undersøgelser har været at klarlægge, som ofte postuleret, om blandinger af pesticider med samme virkemåde følger ADM, mens pesticider med forskellige virkemåder følger MSM. Forsøg med multikomponentblandinger af henholdsvis fenolderivater, s-triaziner, chloracetanilider, sulfonylureaer og phenylureaer viste, at ADM beskrev effekterne af ækvitoksiske blandinger meget præcist, mens MSM som regel undervurderede effekten af disse blandinger af pesticider med samme virkningsmekanisme. Modsat fandt man, at effekterne af blandinger af stoffer med forskellige virkningsmekanismer, hvor typisk kun et mindre antal af komponenterne var pesticider, blev beskrevet mere præcist med MSM, mens ADM overvurderede effekter af disse blandinger.

Sideløbende med de eksperimentelle undersøgelser har de to forskergrupper gennem simuleringer undersøgt under hvilke forhold, ADM og MSM predikterer forskellige effekter, samt hvilke forhold, der påvirker de to referencemodellers forudsigelser. Dette arbejde viste, at antallet af komponenter i blandingerne, doseringskurvernes hældning, forholdet mellem de enkelte komponenter i blandingen samt effektniveauet er parametre, som bestemmer forskellen mellem de to modellers forudsigelser.

De eneste tilfælde hvor MSM prædikterede enten den samme effekt eller en højere effekt end ADM for blandinger af pesticider, var i de relativt få tilfælde, hvor doseringskurverne var meget flade.

Humantoksikologiske undersøgelser

I modsætning til det økotoksikologiske område er MSM konceptet meget udbredt inden for det humantoksikologiske område. Modsat ADM så antager MSM i den form, som den almindeligvis anvendes, at blandes to kemiske stoffer, som hver især ingen effekt har, så vil blandingen ligeledes ingen effekt have. Denne egenskab ved MSM har medført, at der i de senere år er gennemført studier, som har haft til formål at undersøge om dette er en rimelig antagelse. Konklusionen har været, at det er det for stoffer med forskellige virkningsmekanismer, dvs. at risikoen ved en eksponering for sådanne blandinger er lig risikoen ved eksponering for det mest toksiske af stofferne i blandingerne. Derimod vurderes ADM at være den korrekte referencemodel for stoffer med samme virkningsmekanisme.

I litteraturstudiet er den foreliggende litteratur vedrørende pesticiders og andre kemiske stoffers østrogene og antiandrogene effekter præsenteret. Denne gren af humantoksikologien er et eksempel på et område, hvor man antager, at stofferne virker ens, dvs. ADM vurderes at være den korrekte referencemodel. Konklusionerne i litteraturen er da også entydigt, at kombinationseffekterne af pesticider og andre kemiske stoffer kan beskrives meget præcist med ADM. Afvigelser fra ADM er observeret i et enkelt tilfælde, men blev tilskrevet andre toksiske effekter af nogle af de undersøgte stoffer.