Bekæmpelsesmiddelforskning fra Miljøstyrelsen, 106 – Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers skæbne i mave-tarm kanalen - Studier af Bacillus thuringiensis

Mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidlers skæbne i mave-tarm kanalen

4 Diskussion

4.1 Overlevelse og spiring i tarmen
4.2 Påvirkning af den eksisterende bakteriepopulation
4.3 Dannelse af enterotoksiner i tarmen
4.4 Overførsel af DNA i tarmen

For at øge vores viden om den sundhedsmæssige effekt af oral indtagelse af mikrobiologiske plantebeskyttelsesmidler baseret på Bt er flg. punkter blevet undersøgt i rotter fodret med Bt: 1) overlevelse og spiring i tarmen, 2) ændring af den eksisterende bakteriesammensætning, 3) enterotoksinproduktion i tarmen og 4) genoverførsel i tarmen. Resultaterne fra de enkelte punkter vil blive diskuteret grundigt i det følgende.

4.1 Overlevelse og spiring i tarmen

Forsøgene viste, at i rotter fodret med vegetative celler af Bt eller den nærtbeslægtede B. cereus genfandtes ingen eller kun få bakterier i fæces og tarm. Forsøg med sporer og vegetative celler af B. cereus og Bt subsp. kurstaki i simuleret mavevæske viste, at de vegetative celler hurtig blev dræbt. Dette er i overensstemmelse med et andet studie [Clavel et al., 2004], som viste at under pH 4,5 har vegetative celler af B. cereus og Bt svært ved at overleve. Derfor kan den manglende genfindelse af B. cereus og Bt forklares ved at de vegetative celler ikke overlever passagen gennem mavesækken. Plantebeskyttelsesmidler baseret på Bt bliver sprøjtet ud som sporer, som viste høj overlevelse i den kunstige mavevæske selv ved pH 1,5.

Overlevelse gennem mavesækken kan dog ændres hvis bakterierne indtages sammen med fødevarer. Eksempelvis vil fedtholdige fødevarer beskytte bakterierne, så også vegetative celler kan overleve. [Clavel et al., 2004] har vist, at B. cereus celler har en bedre overlevelse i mælk ved lav pH end i andre undersøgte medier. Denne bedre overlevelse kan skyldes at bakterierne bliver fanget i hydrofobe fedtmolekyler, der yder beskyttelse gennem maven [Conway et al., 1987]. Mange fødevarer kunne give den samme beskyttelse for vegetative celler som mælk gør. Endvidere har studier vist at tolerance over for lav pH kan induceres ved at dyrke B. cereus ved subletalt pH [Jobin et al., 2002], f.eks. ved tilberedning af mad. Endelig kan pH i maven under visse omstændigheder være højere, f.eks. hos ældre mennesker, i slutningen af et måltid og ved visse sygdomstilstande. Derfor kan det ikke udelukkes at også vegetative celler kan overleve passagen gennem maven og give anledning til effekter i tarmen.

I modsætning til de vegetative celler viste sporerne god overlevelse gennem maven, og i mange tilfælde kunne bakterien detekteres i fæces selv to uger efter sidste dosering. I de kimfri dyr med Bt subsp. israelensis, var der spiring og vækst af de indgivne sporer i alle dyr. I HFA dyrene kan det kun med sikkerhed siges at være sket i ét dyr fodret med sporer af Bt subsp. kurstaki, hvor der fandtes op til 10⁴ CFU/g i alle tarmafsnit og bakterien kunne endvidere detekteres i milten.

I overensstemmelse med vores resultater har også andre vist at Bacillus sporer er i stand til at overleve og nogle gange spire i mave-tarmkanalen. Tre B. cereus stammer er blevet vist at kunne overleve i mave-tarmkanalen på konventionelle mus 18 dage efter sidste dosering [Duc et al., 2004]. Ligeledes viste et andet dyreforsøg med konventionelle mus at antallet af Bacillus subtilis sporer var højere i fæces end det indgivne antal [Hoa et al., 2001]. Ved at anvende et sensitivt revers transkriptase-PCR assay til detektion af vegetative celler i tyndtarmen blev det endvidere vist, at Bacillus subtilis sporer spirer i mave-tarmkanalen på mus [Casula and Cutting, 2002]. Sporer er ligeledes blevet detekteret i smågrise fodret med vegetative celler [Jadamus et al., 2001]. Sammen med resultaterne fra vores undersøgelse indikerer det, at sporer kan spire i den nærings-rige tyndtarm, gro og efterfølgende sporulere i det mere nærings-fattige og barske miljø i tyktarmen, hvor vandaktiviteten er lav.

Genfindelsen af Bt og B. cereus hele to uger efter sidste dosering kan også skyldes bakteriens evne til at hæfte sig til tarm-cellerne. Studier har vist at bakterier af B. cereus gruppen er mere hydrofobe end andre Bacillus grupper [Ronner et al., 1990] og desuden er overfladen dækket af filamenter [Husmark and Ronner, 1992], som gør dem i stand til at binde til tarmcellerne.

Translokationen af Bt subsp. kurstaki fra tarm til milt i ét dyr ud af seks kræver yderligere studies for at klarlægge risikoen for en sådan translokation. I andre studier har man også isoleret Bt fra organer, men forfatterne af sådanne studier påstår at disse fund skyldes efterfølgende kontamination [McClintock et al., 1995]. Dette kan udelukkes i dette studie, bl.a. fordi milt og lever er taget ud af dyrene før tarmene er åbnet. B. cereus gruppen er kendt for at producere forskellige virulensfaktorer, som f.eks. hæmolysiner, fosfolipaser og cytolysiner [Drobniewski, 1993] som kan destruere værtens vævskomponenter og dermed være involveret i invasion af bakterien. B. cereus kan være årsag til andet end mave-tarm infektioner, både lokalt og systemisk i følsomme befolkningsgrupper som f.eks. immunsvækkede patienter, og også Bt har været associeret med to ikke-mavetarm infektioner, en sår- og en øjeninfektion [Drobniewski, 1993].

4.2 Påvirkning af den eksisterende bakteriepopulation

Et aspekt ved risikovurdering af plantebeskyttelsesmidler baseret på Bt kunne være bakteriens evne til at påvirke sammensætningen af den tilstedeværende normale tarmflora. Bakterier i B. cereus gruppen er kendt for at danne forskellige produkter, der kan have en effekt på andre bakterier, og enkelte underarter af B. cereus anvendes som probiotika til dyr og mennesker, hvor de menes at have en gunstig effekt på sammensætningen af bakterier i tarmen.

Der blev kun observeret få og midlertidige ændringer af den omkringliggende bakterieflora, og vi kan konkludere, at påvirkningen af den normale tarmflora er minimal. Nogle stammer af B. cereus bliver som nævnt brugt som probiotika til mennesker og dyr og et studie med en sådan probiotisk stamme har vist en effekt på E. coli og enterokok populationen [Gedek et al., 1993]. Endvidere er der blevet påvist en signifikant reduktion af koliforme bakterier i tarmprøver fra smågrise fodret med en probiotisk B. cereus stamme (Jadamus et al, 2002). Den samme reduktion af koliforme bakterier har vi observeret i vores forsøg med B. cereus, dog var reduktionen kun midlertidig. Det er usikkert hvorvidt denne påvirkning af den eksisterende bakteriepopulation skyldes vegetative celler eller sporer af B. cereus og Bt. Som forsøgene viser, er bakterierne i de fleste dyr primært tilstede som sporer, og det er derfor sandsynligt, at det er disse, der er ansvarlige for ændringerne, evt. ved at binde sig til tarmepitelceller og derved optage plads for andre bakterier.

I to rotter fodret med sporer af Bt subsp. kurstaki sås en ændring af bakteriesammensætningen i fæces under dosering analyseret vha. DGGE. Dette gælder for dyr 7 fra Hold 2 og dyr 15 fra Hold 3, som begge i perioder har en højere koncentration af Bt subsp. kurstaki i fæces end de andre dyr. I prøverne taget under dosering er der bånd der bliver kraftigere på DGGE gelen sammenlignet med prøverne før dosering. Kloning og sekventering af disse bånd viste op til 99% identitet med Faecalibacterium prausnitzii, en dominerende gruppe i normal human fæcesflora. F. prausnitzii er en butyrat-producerende bakterie, som menes at danne energi til tarmepitelceller og som har en god indflydelse på sundhedstilstanden i tyktarmen. Da der ses en stigning af denne bakterie i doseringsperioden kunne det tyde på, at Bt subsp. kurstaki har en positiv effekt på netop denne bakterie og dermed indirekte på tyktarmens sundhedstilstand.

4.3 Dannelse af enterotoksiner i tarmen

Vero-celle assay på de anvendte stammer viste at den højeste toksin-aktivitet fandtes i Bt subsp. israelensis, formodentlig pga. et nonspecifikt cytotoksisk toksin, der dannes samtidig med insekttoksinet. Plantebeskyttelsesmidler der indeholder denne stamme bruges i Danmark kun på prydplanter. De andre kommercielle stammer der indgik i undersøgelsen, Bt subsp. kurstaki og Bt subsp. tenebrionis, som benyttes til plantebeskyttelse på spiselige afgrøder (hvoraf kun Bt subsp. kurstaki er tilladt på det danske marked), havde en lavere toksin-aktivitet end det B. cereus isolat (F4433/73), der også indgik i undersøgelsen, og som har givet anledning til diarré hos mennesker [Granum et al., 1993].

Dannelse af enterotoksiner i tarmen blev kun observeret i et dyr. Dyret stammede fra forsøgene med kimfri rotter fodret med sporer af Bt subsp. israelensis. Enterotoksinproduktion blev fundet i den midterste del af tyndtarmen både vha. Vero-celle assay og det kommercielle kit, som detekterer en komponent af det hæmolytiske BL toksin. At der ikke kunne detekteres Vero-toksisk aktivitet i de resterende dyr kan skyldes, at vegetative former af de tilsatte bakterier ikke fandtes i tilstrækkelig høj koncentration i tyndtarmen, hvor produktionen af enterotoksiner menes at ske [Granum and Lund, 1997]. De indledende forsøg viste, at der skal være mindst 10⁶ bakterier per ml til stede for at der kan detekteres cytotoksisk effekt på Vero-celler, og i tyndtarmsprøverne fandt vi højst 10⁴ bakterier per g tarmindhold.

Desuden er vi usikre på, om pH forholdene i en normal fungerende tarm er optimale for toksinproduktion, idet det er vist, at en B. cereus stamme ikke dannede L2 komponenten af enterotoksin HBL ved pH5 og 6, men ved pH7 blev komponenten dannet [Jobin et al., 2002]. Denne observation understøtter desuden, at i tilfælde af høj pH værdi i mavesækken (og dermed i tarmen) vil dette, udover at give god overlevelse af bakterierne, også være gunstig for dannelse af enterotoksiner i tarmen.

4.4 Overførsel af DNA i tarmen

En vigtig faktor ved risikovurdering af bakterier anvendt som plantebeskyttelsesmidler er deres evne til at overføre genetisk information til andre bakterier. Her tænkes i første omgang især på gener der koder for resistens overfor antibiotika, men også for andre gener, som f.eks. toksin-gener, er det vigtigt at vide hvorvidt de er overførbare.

For Bt vides det at generne for insekttoksinet oftest sidder på plasmider, der kan overføres til andre Bt, hvilket er årsagen til den store diversitet der ses i arten Bt. Arten er nært beslægtet med Bacillus anthracis, hvis virulens skyldes to store plasmider, pXO1 og pXO2, der ligesom insekttoksin-plasmiderne fra Bt kan overføres mellem medlemmer af B. cereus familien. Det nære genetiske slægtskab mellem arterne af B. cereus familien er blevet underbygget ved DNA sekvens-bestemmelse af et Bt plasmid, og denne har vist stor lighed med pXO2 plasmidet fra B. anthracis [Van der Auwera et al., 2005]. Foruden ligheden med pXO2 havde plasmidet også lighed med plasmider fra andre Gram-positive arter, hvilket sandsynliggør, at DNA-udveksling mellem forskellige arter foregår i naturen.

Udveksling af plasmider vha. konjugation blandt B. cereus arterne er blevet observeret i laboratoriet og i tarmen på insekter, men dette studie er det første, der viser at konjugation også kan ske i en pattedyrs tarm. Da forsøget er blevet udført i en worst-case model med høje koncentrationer af donor og recipient er der dog behov for yderligere studier for at konkludere om overførsel af DNA fra Bt også vil ske i tarmen hos mennesker.

Da der er fundet genetisk lighed mellem plasmider fra Bt og andre Gram-positive bakterier, kunne det være interessant at gentage forsøget, hvor tarmbakterier, f.eks. enterokokker, blev brugt som recipienter.