Påvisning af virus i vand og toskallede bløddyr

BILAG 10

Beskrivelse af evalueringsstudie af detektion af virus i toskallede bløddyr ved RT-PCR (49)

I dette studie undersøgte man om 5 uafhængige laboratorier kunne detektere en kendt mængde Norwalk virus i toskallede bløddyr ved RT-PCR.

Forinden udførte alle 5 laboratorier initial tests, hvor de viste, at de ved RT-PCR kunne detektere 42 kopier af Norwalk virus.

Kontrollaboratoriet, der foretog den samlede undersøgelse, præparerede toskallede bløddyr på følgende måde inden udsending til laboratorierne.

Præparation af toskallede bløddyr inden udsending:

Præparation af de toskallede dyr bestod i, at maver og digestive divertikulaer blev udtaget ved dissektion. In situ transkriptionsstudier har tidligere lokaliseret, at hovedparten af Hepatitis A virus bioakkumuleres i mave og digestive divertikler af toskallede bløddyr (50)

For hvert forsøg blev der lavet 3 separate puljer af toskallede bløddyrs maver og digestive divertikulaer. Til disse puljer blev tilsat:

• 100 RT-PCR units af Norwalk virus pr. 1,5 g toskallet bløddyrsvæv til pulje 1
• 1000 RT-PCR units af Norwalk virus pr. 1,5 g toskallet bløddyrsvæv til pulje 2
• negativ kontrol:0 RT-PCR units af Norwalk virus pr. 1,5 g toskallet bløddyrsvæv til pulje 3.

En RT-PCR unit repræsenterede ca. 42 kopier af Norwalk virus-genom (beskrivelse af RT-PCR unit i ref. 48) og blev benyttet, fordi Norwalk virus ikke kan gro i cellekulturer eller kvantificeres ved elektronmikroskopi.

Vævene blev homogeniseret i en opløsning af 7,3 ml PBS og 0,2 ml antifoam per 1,5 g toskallede bløddyr i 4 x 60 sek. intervaller på høj speed med en semi-microcontainer (Eberbach Corp., Ann Arbor, Mich) forbundet til en power unit.

De deltagende laboratorier fulgte følgende protokol:

1. dag. Processing

• lige efter modtagelsen blev 9 ml prøver overført til 50 ml polyallomer rør
• shipping-røret blev skyllet efter med 3 ml PBS, som herefter overførtes til de 9 ml prøve
• 6 ml kloroform:butanol (1:1 vol/vol) blev tilsat hver prøve, der blev blendet på vortex i 2x30 sek. med 15 sek. hvileinterval
• Cat-Floc T (polydimethyl diallyl ammoniumchlorid, en polykationisk elektrolyt, der benyttes ved behandling af spildevand, er succesfuldt blevet benyttet til genfindelse af enterovirus fra østers (24)) blev tilsat til en endelig koncentration på 2,7 procent
• prøverne blev blandet ved vending i 5 min ved stuetemperatur
• centrifugering 13500xg i 15 min ved 4⁰C
• vandig fase blev overført til rent rør indeholdende 6,5 ml af polyethylenglycol PEG 6000 (24%wt/vol) og 1,2 M NaCl
• prøverne inkuberes under svag bevægelse i 1 time ved 4⁰C
• centrifugeredes i 20 min. ved 11000xg ved 4⁰C
• supernatant blev fjernet ved dekantering, og pellet blev opbevaret over nat ved 4⁰C

1. dag RNA ekstrahering

• PEG-pellet blev resuspenderet i 3 ml vand
• proteinase K fordøjelse (0,2 mg/ml ved endelig koncentration) i 30 min. ved 56⁰C
• prøverne ekstraheredes 2x med et lige volumen af phenol-chloroform-vand (68:18:14)
• den vandige fase blev præcipiteret i opløsning indeholdende 3 volumner af ethanol og 1/10 volumen af 3 M NaCH₃ COO (pH 5,2) i 30 min. med tør-is-ethanol
• centrifugering ved 15000xg i 30 min.
• pellet resuspenderedes i vand
• CTAB (cetyltrimethylammoniumbromid, kationisk detergent, der precipiterer nukleinsyre og nogle proteiner, hvorimod andre proteiner og polysakkarider bliver i opløsningen) og NaCl blev tilsat til endelige koncentrationer på henholdsvis 1,4% og 0,11 M
• prøverne blev inkuberet i 15 min. ved stuetemperatur og centrifugeret 30 min. ved 15000xg ved 25⁰ C
• pellet blev genopløst i 1 M NaCl og præcipiteret i en opløsning indeholdende 3 volumener ethanol og 1/10 volumen 3 M NaCH₃COO (pH 5,2)
• det præcipiterede nukleinsyre blev genopløst i 100 m l vand, hvoraf 20 m l blev brugt til RT-PCR.

Revers transkription:

20 m l prøve og en reaktionsblanding på 30 m l bestående af 10mM tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ , 3,3 m M af primer NVp36 (se nedenfor), 667 m M deoxynukleotidtrisphosphat (dNTP),

20U Rnasin og 5 U avian myeloblastosis virus reverse transkriptase blev blandet og inkuberet 1 time ved 43⁰ C

PCR:

Primere: Norwalk virus primerne NVp36 og NVp36 amplificerer polymerase regionen, og området svarer til 470 basepar. Der er sekvensvariabilitet i polymeraseregionen, og der er endnu ikke udviklet et enkelt sæt af primere, der vil kunne amplificere hele Norwalk virus gruppen (27).

• Til reaktionen tilsættes en PCR-blanding på 70 m l bestående af 10 mM tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ , 1 m M af hver primer, 200 m M deoxynukleotidtrisphosphat (dNTP) og 5 U Taq polymerase
• thermocykler var: 94⁰ C i 4 min. (denaturering), 40 cykler af 94⁰ C i 1 min., primer annealing ved 55⁰ C i 1,5 min., primer extension ved 72⁰ C i 1 min., endelig extension ved 72⁰ C i 15 min.
• PCR-prdukt analyseres på agarosegel med DNA-markør, der forventes et DNA-bånd på ca. 470 nukleotider.

Resultater:

Alle resultater, undtagen et (lab.B), havde tolkbare resultater i alle forsøg. Laboratorie B havde negativ svar på de positive kontroller i nogle af forsøgene, også selvom alle reagenser blev udskiftet. Laboratorie D var det eneste, der havde alle resultaterne rigtige.

Der blev fundet en sensitivitet på 81% (antal fundne positive prøver ud af det totale antal prøver med virus) ved detektion af 100 RT-PCR units i 1,5 g toskallede bløddyr mave og digestive divertikula (svarende til 4200 kopier af Norwalk virus RNA genom). Ud af 27 forsøg var der 22 positive reaktioner, hvilket giver en sensitivitet på 81%.

Man fandt 17 positive ud af 19 testprøver, hvor der var tilsat 1000 RT-PCR-units pr. 1,5 g toskallede bløddyr mave og digestive divertikula (svarende til 42000 kopier Norwalk virus RNA genom), resulterende i en sensitivitet på 89%.

Specificiteten, defineret som antal fundne negative prøver (0 virus tilsat) ud af total antal negative prøver, blev bestemt til 91% (21/23, 2 var nemlig falske positive bedømt efter agarose gelelektroforese).

For at analysere resultaterne yderligere udførte kontrollaboratoriet (dvs. det blev udført efter de deltagende laboratorier havde afleveret deres resultater) Southern hybridisering på PCR-produkterne. Herved øgedes sensitiviteten til 85% for 100 RT-PCR units i 1,5 g væv og specificiteten til 100% (ingen af de to tidligere fundne falske positive prøver viste positivt resultat i Southern blot).

Der var kun et laboratorie ud af 5, der fandt positive resultater i alle prøver indeholdende virus. 3 ud af 5 laboratorier havde mindst en "falsk" negativ prøve, hvilket måtte skyldes tilstedeværelse af inhibitorer.

Konklusion:

Teknikken viste, at der kunne detekteres 4200 kopier af Norwalk virus RNA genom i 1,5 g væv fra toskallede bløddyr. Resultaterne viste endvidere, at hybridiseringsassay øgede sensitiviteten og specificiteten. I nogle tilfælde optrådte falske negative prøver, hvilket skyldtes tilstedeværelsen af PCR-inhibitorer i prøvematerialet.