Påvisning af virus i vand og toskallede bløddyr
BILAG 11
Detektion af hepatitis A virus i miljøprøver ved antigen capture RT-PCR (46)
I dette studie beskrives en antigen capture RT-PCR metode til detektion af hepatitis A
virus i miljøprøver og toskallede bløddyr. Der er her fokuseret på antigen capture
RT-PCR på toskallede bløddyr.
Processing:
Østers og muslinger blev tilsat virus, afskallet og hakket. Der blev tilsat kold 0,09
M Glycin i 0,01 NaOH buffer (pH 8,8) og blandet i 1-2 min.. Cat-Floc blev tilsat. Efter
blanding inkuberedes i 15 min. ved 40 C. Der blev filtreret gennem Whatmanpapir
efterfulgt af filtrering gennem 0,2 µm filter. Filtratet var da klar til analyse ved
plaque assay ( infektiøse virus, PFU, i cellekultur) og antigen capture RT-PCR . Ved
plaque assay var det nødvendigt at benytte en hurtigt voksende cytolytisk hepatitis A
virus variant, da vildtype hepatitis A virus vokser meget langsomt eller slet ikke i
cellekulturer.
Antigen-capture:
Sterile 0,5 ml polypropylen mikrocentrifugerør blev coated med anti-hepatitis A virus
IgG ved inkubering i 4 timer ved 37 0 C. Ikke-bundet IgG blev fjernet og 1 %
bovinserum tilsat. Efter inkubering 1 time ved 37 0 C vaskes 3x med PBS
indeholdende Tween. Skaldyrsfiltratet blev tilsat, og der blev inkuberet natten over ved
40 0 C, efterfulgt af vask 6 x i buffer bestående af 20 mM Tris (pH 8,4) + 7,5
mM KCl + 2,5 mM MgCl 2.
Primere:
Der blev benyttet to primere, der flankerer et meget konserveret område kodende for
carboxyl- enden af kapsidprotein VP3 og amino-enden af protein VP1.
Reverse transkriptase:
48 µl reaktionsblanding indeholdende PCR-buffer II, 4 mM MgCl 2, deoxyribonukleotider
(dNTP) i en koncentration på 0,4 mM og 1,2 µM hepatitis A virus-primer 2. Efter
denaturering i 5 min. ved 95 0 C blev der afkølet på is. 1 µl RNase
inhibitor (20 U/µl) og 1 µl Moloney murin leukæmivirus revers transkriptase (50 U/µl)
blev tilsat. Der blev inkuberet i 30 min. ved 420 C, 5 min. ved 990 C
og 5 min. ved 50 C. Produktet er første streng cDNA.
PCR:
Til ovenstående reaktion tilsættes 50 µl af en PCR-blanding bestående af 1x
PCR-buffer II, 1,2 µM HAV-primer 1 og 2,5 U Taq DNA-polymerase. Efter opvarmning til 950
C i 2 min. fulgte 35 PCR- cykler af denaturering ved 950 C i 1 min.,
annealing og extension ved 600 C i 1 min. Afslutningsvis var der 7 min.
extension ved 600 C. Dernæst analyseres PCR-produktet (247 basepar) på
agarosegel.
Resultater:
Ud fra sensitivitetsstudier på spildevandsprøver fandtes, at antigen capture RT-PCR
metodes detektionsgrænse var på 0,053 PFU for en hepatitis A virusstamme (HM175/18f en
hurtigt voksende cytolytisk variant), hvorimod detektionsgrænsen ved plaque assay var 1
PFU pr. 0,5 ml podestof (inoculum). Sensitiviteten er altså ca. 20 gange større for
antigen capture RT-PCR end for plaque assay. For at estimere hvad en PFU svarede til i
viruspartikler, lavede de cDNA-RNA hybridisering og målte optisk densitet (OD).
Viruspartikel/PFU ratio fastslås til 79:1. Ud fra dette ræsoneredes, at
detektionsgrænsen var på 4 viruspartikler ved antigen capture RT-PCR. Sensitiviteten af
antigen capture RT-PCR var af samme størrelsesorden som konventionel RT-PCR.
Forsøg på detektion af virus i toskallede bløddyr ved antigen capture RT-PCR viste
sig at være lige så sensitiv som plaque assay forsøg på toskallede bløddyr, når der,
vel at mærke, blev anvendt en laboratoriestamme af virus, der gror i cellekultur.
Konklusion:
Sensitiviteten af antigen capture RT-PCR var af samme størrelsesorden som konventionel
RT-PCR, men en egentlig detektionsgrænse blev ikke beskrevet i dette studie.
|