Påvisning af virus i vand og toskallede bløddyr

BILAG 9

Generel beskrivelse af PCR:

Ved Polymerase Chain Reaction (PCR) syntetiseres der in vitro store mængder af et givent nukleinsyre-segment mellem to oligonukleotid primere. Der kan således dannes store mængder amplificeret nukleinsyre ud fra få kopier af original nukleinsyre ved at gentage en proces bestående af denaturering (dobbeltstrenget DNA separeres til enkeltstrenget) i forbindelse med opvarmning til 95⁰ C og forlængelse af primere med en varmeresistent DNA-polymerase (figur 1). Ved PCR kan man således, på meget kort tid, amplificere et ønsket DNA-segment fra et lille kvantum DNA i et prøvemateriale. Teknikken forudsætter, at de flankerende DNA sekvenser er kendt.

PCR reaktionen har en høj sensitivitet, idet man er i stand til at påvise ned til 10 kopier af en specifik nukleinsyresekvens (fx. virus) i en vævsprøve. Denne detektionsgrænse er dog endnu ikke beskrevet for detektion af virus i toskallede bløddyr.

Fra væv isoleres DNA eller RNA. Proceduren består i, at vævet homogeniseres, cellerne lyseres, proteiner og lipid ekstraheres og endelig udfældes nukleinsyre.

Ved undersøgelse for eksempelvis adenovirus, vil PCR kunne udføres direkte på ekstraheret DNA materiale. For prøver, hvorfra der er ekstraheret RNA, er det dernæst nødvendigt at syntetisere copy DNA (cDNA) ud fra virus RNA sekvenser, inden PCR kan anvendes. Dette gøres ved at inkubere RNA prøven sammen med enzymet revers transkriptase. Når revers transkription foretages før PCR, kaldes metoden RT-PCR. cDNA-prøven blandes derefter med Taq DNA polymerase (varmestabil), dNTP’s og primere i en magnesiumholdig buffer og anbringes til sidst i en thermocykler, der automatisk skifter mellem de tre temperatur (denaturering, primer annealing og primer extension). Som regel lader man reaktionen forløbe over 30-35 cykler.

PCR-produktet kan visualiseres ved agarosegel-elektroforese og ethidiumbromid farvning overfor en kendt DNA markør. Ved denne teknik udnyttes, at DNA er negativt ladet pga. de sure fosfatgrupper. DNA fragmenter bevæges derfor mod den positive pol. Små fragmenter vandrer hurtigere end store. Udfra en kendt DNA-markør på samme gel, kan PCR-produktets størrelse estimeres og sammenholdes med den forventede størrelse af amplikon.

Figur 1 : Se her

PCR er en cyklisk proces, hvor antallet af DNA molekyler fordobles efter hver cyklus. Det dobbelstrengede DNA denatureres ved opvarmning og afkøles derefter, så primeren kan binde til det komplementære område.

Herefter forlænges primeren af DNA polymerasen ved at inkorporere nye komplementære deoxyribonukleotider. Processen kan i princippet gentages i det uendelige. Antallet af kopier er 2ⁿ for hvert udgangskopi, hvor n er antallet af cykler. Rutinemæssigt gentages processen ca. 30 gange, dvs. at der dannes 2 ³⁰= 1 milliard kopier fra hvert udgangskopi. Da PCR er en meget sensitiv metode, er der risiko for at få PCR reaktionerne kontamineret med falsk positive reaktioner til følge.

Derfor bør man altid have negative kontroller med, benytte pipetter, der kun benyttes til dette formål samt præparere prøver i et rum og blande reaktionsmix og køre reaktionen i et andet rum. Normalt inkluderes også en positiv kontrol.

Nukleinsyre hybridisering:

For at få bekræftet at PCR-produktet er det "rigtige", kan der laves nukleinsyre-hybridisering efterfølgende. Det amplificerede produkt agarosegelelektroforeres, og PCR produktet denatureres og blottes (overføres) over på en nylonmembran.

En nukleinsyre-probe, dvs. en nukleinsyrestreng fremstillet med en basesekvens, der er komplementær til et givent område af det stykke virusnukleinsyre, man ønsker at påvise, anvendes til specifik identificering af PCR-produktet. Proben kan mærkes med radioaktiv ³²P.

Nylonmembranen inkuberes med en hybridiseringsvæske indeholdende nukleinsyre-probe. Derefter vaskes membranen og film lægges på. Ved autoradiografi ses, om der er sket en hybridisering (binding af probe) til virusnukleinsyre. Proberne kan også kobles med biotin og digoxigenin, som derefter påvises ved binding til en anden mærket forbindelse.