Påvisning af virus i vand og toskallede bløddyr

5.  Påvisning af virus i toskallede bløddyr

5.1 Introduktion
5.1.1 Hvordan opkoncentreres virus i toskallede bløddyr
5.1.2 Hvilke toskallede bløddyr
5.1.3 Hvilke virus opkoncentreres i toskallede bløddyr
5.1.4 Virusepidemier i Danmark ved indtagelse af toskallede
bløddyr
5.1.5 Indikator
5.1.6 Viruselimination fra toskallede bløddyr
5.2 Generelt om metoder
5.3 Molekylærbiologiske metoder
5.4 PCR til påvisning af virus i toskallede bløddyr
5.5 Opsummering og diskussion

Det fremår af litteraturgennemgangen, at der ud fra molekylærbiologiske strategier med anvendelse af RT-PCR (revers transkription polymerase chain reaction) er udviklet de første følsomme teknikker til påvisning af virus i toskallede bløddyr. Der er behov for at videreudvikle sådanne teknikker til monitorering af virus i toskallede bløddyr, vand og sediment. Videre studier er nødvendige for specielt at belyse anvendeligheden af molekylærbiologiske teknikker til påvisning af virus af human oprindelse i toskallede bløddyr.

5.1.1Hvordan opkoncentreres virus i toskallede bløddyr

Toskallede bløddyrs rolle i transmission af humane virale sygdomme har været kendt længe (24).

Filterernærende  mekanisme

Virus opkoncentreres i toskallede bløddyr, såsom østers og muslinger, idet disse toskallede bløddyr har en "filterernærende" mekanisme, der består i at si fødepartikler, der er suspenderet i det omgivende vand. Denne filtermekanisme sker via gællerne, idet gællerne er "site" for optagelse af ilt og næring. Gællerne har en overordentlig stor overflade, der er tæt besat med cilier, som driver vandet gennem gællerne videre til munden. Faste partikler, herunder virus, fastholdes af et slimlag og føres af ciliestrømmen hen over gællernes overflade til munden. På den måde virker gællerne som et sigteapparat, hvorved virus opkoncentreres i de toskallede bløddyrs fordøjelseskanal (25).

Filterhastighed

Filtreringshastigheden varierer en del afhængig af temperaturforhold og de toskallede bløddyrs fysiologiske aktivitet. Fysiologisk aktive toskallede bløddyr kan filtrere op til 38 l (10 gallon) vand i timen over en kortere periode, og det antages, at toskallede bløddyr kan opkoncentrere virus fra det omgivende vand mindst 100 fold (26). Da toskallede bløddyr ofte spises rå eller lettere kogt, er der dermed risiko for smitte med humane enteriske virus.

Human fæces kan indeholde mere end 1x10⁶ infektiøse virus per gram. I spildevand er der målt viruskoncentrationer på op til 1x10⁵ pr. l. Da viruspartikler kan bevare infektiøsiteten flere måneder i vand, anses spildevand for at være den vigtigste kilde til human patogen virusforurening af de toskallede bløddyrs miljø (25).

Der er til dato ikke rapporteret om virusinfektioner efter indtagelse af ikke-toskallede bløddyr, såsom hummer og reje, og det antages, at disse bløddyr ikke udgør nogen risiko for transmission af virus.

5.1.2Hvilke toskallede bløddyr

Man har fundet human virustransmission i forbindelse med indtagelse af mange arter af toskallede bløddyr. Dette gælder asiatisk østers (Crassostrea virginica), europæisk østers (Ostrea edulis), Sydney Rock østers (Crassostrea commercialis), Pacific østers (Crassostrea gigas) hårdskals musling (Mercenaria Mercenaria) blødskals musling (Mya arenaria), blåmusling (Mytilis edulis), hjertemusling (cardium edul) og forskellige italienske og kinesiske muslinger (26).

5.1.3Hvilke virus opkoncentreres i toskallede bløddyr

De humane virus, der kan overleve i miljøet, er primært enteriske virus, som er meget resistente overfor ydre påvirkning. Dette gælder Adenoviridae, Caliciviridae, Astroviridae og Picornaviridae, og det er hovedsageligt gruppen af Norwalk virus (tilhørende genus Calicivirus inden for familien Caliciviridae) og hepatitis A virus (tilhørende genus Hepatovirus inden for familien Picornaviridae), der har været årsag til epidemier i forbindelse med indtagelse af toskallede bløddyr. Både Norwalk virus og hepatitis A virus har et enkeltstrenget RNA genom med positiv sense, og begge virus er stabile og relativt resistente mod klorin (30).

Norwalk virus kan forårsage akut gastroenteritis, inkubationstiden er kort (1-2 døgn), og den akutte kliniske fase varer typisk 1-2 døgn. Symptomerne er utilpashed, mavesmerter, feber, diarré og/eller opkastning (27).

Hepatitis A virus kan forårsage sygdom i form af akut hepatitis. Symptomerne er feber, kvalme og hovedpine, der efterfølges af opkast, diarré, artritis og eventuelt gulsot. Infektionen er selvbegrænsende og sjælden fatal. Inkubationstid for infektion er 2-6 uger med en gennemsnitstid på 28 dage (55).

Virusepidemi

Der har været flere udbrud med hepatitis A virus forårsaget af indtagelse af toskallede bløddyr. Det største udbrud indenfor de seneste år opstod i Shanghai i 1988, hvor der blev rapporteret over 300.000 tilfælde af hepatitis A virusinfektioner (28, 29). Det var primært unge mennesker, som havde indtaget rå muslinger fra forurenet vand, der blev angrebet. Senere opstod sekundær smitte ved person til person transmission.

5.1.4Virusepidemier i Danmark som følge af indtagelse af toskallede bløddyr

Omkring årsskiftet 1995/1996 registreredes der i Danmark sygdom hos mindst 224 personer efter indtagelse af østers. Symptomerne var opkast, diarré og kraftige mavesmerter, som optrådte 1-2 døgn efter indtagelse og varede 1-2 døgn. De østers, der menes at have relation til sygdomsudbruddet, stammede fra 3 partier á 25000 stykker fra England. Østers fra de tre partier blev sendt til undersøgelse på Fish Disease Laboratory i Weymouth, England. Der blev påvist Norwalk virus ved polymerase chain reaction (PCR)(31).

Omkring nytår, det efterfølgende år, optrådte et nyt sygdomsudbrud, hvor mere end 350 personer blev syge efter indtagelse af europæiske østers. De registrerede symptomer var opkast, diarré, feber og hovedpine med efterfølgende synsforstyrrelser, svimmelhed, følelsesløshed af hud, ansigt, hænder og ben. De neurale symptomer opstod hos 50% af personerne og varede op til 3-4 uger.

Small Round Structured Virus

I 13 ud af 25 fæcesprøver blev der påvist Small Round Structured Virus (SRSV) ved elektronmikroskopi, udført af Virologisk afdeling, Statens Serum Institut, København. Østersprøver blev fundet positive for Norwalk virus og enterovirus ved PCR udført af Fish Disease Laboratory i Weymouth (32).

5.1.5Indikator

Indikator

I Fiskeriministeriets bekendtgørelse fremgår grænseværdier på 300 fækale coliforme bakterier eller mindre end 230 E.coli pr. 100 g væv og væske for, at de levende toskallede bløddyr må anvendes direkte til konsum (54). Flere studier har dog vist, at enteriske virus kan være til stede i toskallede bløddyr og give anledning til toskallede bløddyrsbåret sygdom, også når antallet af indikatorbakterier har været indenfor det acceptable niveau (26).

Bakteriofager

Male-specifikke (F+) bakteriofager har været foreslået som indikator for viral forurening af havmiljø, og disse (F+) bakteriofager har også været benyttet i rensningsstudier af toskallede bløddyr (33).

5.1.6Viruselimination fra toskallede bløddyr ved rensning og genudlægning

Rensning og genudlægning er metoder, der er baseret på, at toskallede bløddyr er i stand til via deres filterernærende mekanisme, fordøjelse og ekskretion at eliminere kontaminerende mikroorganismer fra fordøjelseskanalen.

Rensning af toskallede bløddyr kan foregå i tanke eller bassiner med vand behandlet med ultraviolet lys eller ozon (34). For at opnå optimal rensning er det vigtigt, at de øvrige miljømæssige betingelser er bevaret. Rensning kan også ske ved genudlægning, der indebærer, at de toskallede bløddyr flyttes til et område i de naturlige omgivelser, der ikke er forurenet.

Uoverensstemmelse

Den konventionelle rensningstid er 48 timer, og der er observeret overensstemmelse mellem eliminationsraten for bakterielle patogener og fækale indikatorbakterier. Derimod er der forskel i eliminationsraten for indikatorbakterier og virus. Endvidere er der undersøgelser, der peger på at hepatitis A virus ikke elimineres med samme hastighed som enterovirus. Dette kan forklare, hvorfor der har været hepatitis A udbrud i forbindelse med indtagelse af såkaldt "rensede" østers. I et andet studie (34), hvor en gruppe frivillige personer indtog toskallede bløddyr, der var renset i 48 timer og indeholdt et acceptabelt niveau af fækale indikatorbakterier, blev 37 % af gruppen syge som følge af infektion med Norwalk virus.

Elimineringsrater

Elimineringsraterne af forskellige indikatormikroorganismer i muslinger og østers er undersøgt. Bakteriofager blev elimineret væsentligt langsommere end tilfældet var for fækale coliforme, E. coli, enterococci og en sporedannende anærob bakterie (Clostridium perfringens). Uanset om rensningssystemet bestod af ozonbehandlet vand eller vand behandlet med ultraviolet lys, var der stadig bakteriofager i de rensede toskallede bløddyr efter 2 uger (57).

Ovenstående peger på, at fækale coliforme, heller ikke i denne sammenhæng, er en tilstrækkelig indikator for viruskontaminering.

5.2Generelt om metoder til påvisning af virus i toskallede bløddyr

Flere oversigtsartikler over virus af human oprindelse i toskallede bløddyr er inkluderet i nærværende litteraturliste (24, 26, 34, 35, 36, 37). De fleste publikationer på området omhandler studier af eksperimentelt virussåede toskallede bløddyr, hvor virusoptagelse, spredning og elimination i de toskallede bløddyr er undersøgt.

Opkoncentrering

Virus findes generelt i så lave koncentrationer i toskallede bløddyr, at de som regel ikke kan detekteres ved isolation i cellekulturer uden en forudgående opkoncentrering og elimination af cytotoxiske forbindelser. Der findes forskellige metoder til dette formål, hovedparten af metoderne indebærer homogenisering af toskallede bløddyrkødet med eller uden diluent, efterfulgt af centrifugering med henblik på at fjerne fast materiale, jf. bilag 8.

Før molekylærbiologiske metoder, som PCR og hybridisering, blev udviklet, var cellekultur assay den primære teknik til at detektere virus i toskallede bløddyr. En fordel ved disse metoder er, at det er infektiøse virus, der detekteres. Til gengæld er metoderne behæftet med væsentlige ulemper, idet metoderne er tids- og arbejdskrævende og varierer i sensitivitet afhængig af virustype, celletype og inokulationsmaterialet. Inokulationsmaterialet fra toskallede bløddyr kan i høj grad have en cytotoksisk effekt i cellekulturen, og en anden væsentlig ulempe er, at visse virus enten slet ikke eller kun vanskeligt kan isoleres i cellekulturer. Dette gælder eksempelvis hepatitis A virus, der gror meget dårligt og langsomt i cellekulturer, og Norwalk virus, der ikke har vist sig at være dyrkbare in vitro. Ligeledes har enterovirus vist sig at være vanskelige at isolere i cellekulturer fra toskallede bløddyrsmateriale (27). Cellekultur assays er således ikke egnede metoder til påvisning af hepatitis A og Norwalk virus i toskallede bløddyr.

Immunologiske assay system, som EIA (enzyme immunosorbent assay) og RIA (radio immuno assay) har også været benyttet til at påvise virusantigen i materiale fra toskallede bløddyr. Disse metoder har dog ikke vist sig at have en tilstrækkelig høj følsomhed (35). Således blev den nedre detektionsgrænse bestemt til 10⁴-10⁵ partikler/g for RIA (30).

Elektronmikroskopi

Elektronmikroskopi giver mulighed for visuelt indtryk af viruspartikler i prøvematerialet, men ulempen ved at benytte elektronmikroskopi er, at detektionsgrænsen kan være helt op til 10⁶ viruspartikler/g/ml. For små virus, som picornavirus, kan detektionsgrænsen være endnu højere (56).

Denne høje detektionsgrænse gør, at metoden ikke er velegnet til direkte detektion af virus i toskallede bløddyr.

5.3 Molekylærbiologiske metoder

Den seneste udvikling inden for det molekylærbiologiske felt har ført til udvikling af hurtige, sensitive og specifikke metoder til påvisning af virus i toskallede bløddyr (38 - 47). Den højeste sensitivitet i forbindelse med viruspåvisning i toskallede bløddyr er således opnået med metoder, der gør brug af amplifikation af virus-nukleinsyre i prøvematerialet polymerase chain reaction (PCR). PCR-teknikker er beskrevet nærmere i bilag 9.

For enterovirus vedkommende er der fundet primere, der detekterer en bred række af stammer inden for genus (38).

Kloning af genomer af hepatitis A virus og Norwalk virus, som er de primære humane virale patogener, der kan overføres via toskallede bløddyr, har muliggjort udviklingen af genteknologiske metoder til påvisning af også disse virus (35).

For Norwalk virus er der endnu ikke udviklet et enkelt sæt primere, der kan amplificere alle kendte genotyper.

Fordele

Fordele ved PCR er følgende:

• øget sensitivitet.

• resultat opnås generelt hurtigere end ved andre virusdetektionsmetoder

• en bred vifte af virus kan påvises

Ulemper

Ulemper ved PCR er følgende:

• i forbindelse med prøver fra toskallede bløddyr kan der opstå problemer som følge af kemiske inhibitorer, der hæmmer en eller begge enzymer (revers transkriptase og Taq-polymerase) i processen. Der er forsket i at udvikle ekstraheringsprocedurer, der eliminerer disse kemiske inhibitorer (39, 40, 41, 42) .

• i forbindelse med påvisning af virus i toskallede bløddyr har man fundet, at bløddyrenes polysakkarider hæmmer reaktionerne. Ved anvendelse af en kationisk detergent som cetyltrimethylammonium bromid (CTAB) til prøvematerialet efter fenol-kloroform ekstrahering eliminineres disse polysakkarider (42).

5.4 PCR anvendt til påvisning af virus i toskallede bløddyr

Anvendelse af PCR er beskrevet for hepatitis A virus, for rotavirus, for Norwalk virus og for enterovirus (39 - 47, 51). En del af disse studier omhandler udvikling af metoder til at isolere virale nukleinsyrer fra toskallede bløddyr, der i forvejen eksperimentelt er tilsat virus.

RT-PCR til detektion af Norwalk virus

Nogle af de seneste velunderbyggede studier over detektion af virus i toskallede bløddyr er gennemgået i bilag 10 - 12. Teknikkerne er følgende: RT-PCR til detektion af Norwalk virus i toskallede bløddyrsvæv (49, bilag 10), detektion af hepatitis A virus i miljøprøver herunder toskallede bløddyr ved antigen-capture RT-PCR (51, bilag 11) og detektion af hepatitis A virus, rotavirus og enterovirus i toskallede bløddyr ved seminested RT-PCR (38, bilag 12).

Evaluering af RT-PCR

Evaluering af RT-PCR til detektion af Norwalk virus i toskallede bløddyr (49) viste, at teknikken kunne detektere 4200 kopier af Norwalk virus RNA genom i 1,5 g væv fra toskallede bløddyr. Resultaterne viste endvidere, at hybridiseringsassay øgede sensitiviteten og specificiteten. I nogle tilfælde optrådte falske negative prøver, hvilket skyldtes tilstedeværelsen af PCR-inhibitorer i prøvematerialet.

Påvisning af Hepatitis A virus

Til påvisning af hepatitis A virus i miljøprøver, herunder toskallede bløddyr er en antigen capture teknik beskrevet (51, bilag 11). En fordel ved antigen capture RT-PCR er, at hele viruspartikler fanges af antistof, inden RT-PCR foretages. Dermed kombineres specificiteten af antigen capture af virus med sensitiviteten ved PCR. Metoden involverer ikke tidskrævende RNA ekstraherings- og præpareringstrin, i modsætning til konventionel RT-PCR-teknik (bilag 10). Endvidere forekommer antigen-capture proceduren at være effektiv til at eliminere RT-PCR inhibitorer i prøvematerialet.

Seminested RT-PCR

Sensitiviteten af antigen capture RT-PCR er af samme størrelsesorden som konventionel RT-PCR, men en egentlig detektionsgrænse er ikke beskrevet i nærværende litteraturgennemgang.

Semi-nested RT-PCR er anvendt til detektion af hepatitis A-, entero- og rotavirus i toskallede bløddyr fra naturen (38, bilag 12). Princippet i semi-nested RT-PCR er, at man udfører en ekstra PCR på sit første PCR produkt. Ved anden PCR amplificering anvendes den ene af primerne fra den første PCR, medens den anden primer svarer til et område længere inde på det først amplificerede produkt (teknikken er beskrevet i bilag 12).

I det beskrevne arbejde (38) konkluderedes det, at semi-nested PCR var mere sensitiv, altså havde lavere detektionsgrænser, end konventionel PCR. Efterfølgende hybridisering af PCR-produkter til probe øgede yderligere sensitiviteten, hvilket er i overensstemmelse med tidligere fund (49). Det skal understreges, at der ikke fandtes nogen korrelation mellem påvisning af viral og bakteriel forurening i prøverne fra de toskallede bløddyr, hvilket bekræfter, at bakterielle indikatorer er utilstrækkelige som mål for, at toskallede bløddyr er fri for infektiøse humane patogene virus.

Detektionsgrænser

Der er i følge nærværende litteraturstudie rapporteret følgende detektionsgrænser for virus i toskallede bløddyr ved PCR-metoder: 1200 hepatitis A virus-partikler/g væv, 2000 enterovirus-partikler/g væv og 5000 rotavirus partikler/g væv (38). For Norwalk virus er fundet en detektionsgrænse på 4200 viruspartikler/1,5 g væv (49).

Laveste infektiøse enhed

Det skal i den forbindelse nævnes, at den laveste infektiøse enhed, eksempelvis for Norwalk virus i den menneskelige organisme, sandsynligvis ligger under de hidtil undersøgte molekylærbiologiske teknikkers detektionsgrænser.

Oversigt over fordele og ulemper

En oversigt over fordele og ulemper, samt detektionsgrænser ved de forskellige metoder til detektion af virus i toskallede bløddyr findes i bilag 13.

5.5Opsummering og diskussion.

Vurdering af PCR-metoden

Efter en gennemgang af aktuelle videnskabelige artikler vedrørende metoder til virusdetektion i toskallede bløddyr, kan der konkluderes at RT-PCR og efterfølgende hybridisering er en anvendelig og lovende metode. En teoretisk indsigelse mod PCR-teknikken generelt er, at der "kun" detekteres nukleinsyre, hvilket ikke er ensbetydende med tilstedeværelsen af infektiøse virus. Imidlertid stammer nukleinsyre, der er isoleret fra enteriske virus, i stort omfang fra intakte virioner.

Enteriske virus er typisk effektive til at lave fuldlængde kopier af deres genom, så en positiv reaktion med PCR er en god indikation for, at det originale materiale indeholder infektiøs virus (38, 52). Forsøg har vist, at der ikke kan amplificeres viral RNA i miljøprøver (havvand), når proteinase K digestion, der nedbryder viruskapsidet, er udeladt (38). Dette peger på, at det hovedsageligt er indkapslet viralt RNA, der amplificeres ved PCR.

Kombination af PCR og cellekultur

Hvis infektiøsitet ønskes bekræftet, ville det være relevant at kombinere PCR og cellekultur assay i de tilfælde, hvor virus kan vokse i kulturer. Imidlertid har enterovirus fra toskallede bløddyr og hepatitis A virus vist sig vanskelige at isolere i cellekulturer, og Norwalk virus er som tidligere nævnt ikke dyrkbare in vitro. En undersøgelse fra 1995 (53) belyser det generelle forhold, at det er uhyre vanskeligt, at finde en realistisk korrelation mellem RT-PCR detekterede virusnukleinsyre og infektiøse virus.

Anvendeligheden af PCR og cellekultur

Crance et al. (53) undersøgte således korrelationen mellem infektiøse hepatitis A virus (cellekultur) og hepatitis A virus RNA fundet ved nested-RT-PCR i blåmuslinger og hjertemuslinger fra toskallede bløddyrsbede. Disse havde kort forinden været årsag til toskallede bløddyrsbåret hepatitis A virus udbrud. Viralt RNA blev detekteret i 16 prøver ved semi-nested RT-PCR, mens replikation i cellekultur kun blev observeret i 4 af de PCR positive prøver.

Konklusion

Som konklusion på nærværende litteratursøgning forekommer antigen capture RT-PCR med efterfølgende hybridiseringer på væv fra toskallede bløddyr at være en god strategi. Resultater har vist, at det er vigtigt at isolere mave og digestive divertikler, hvori virus befinder sig, fremfor at udføre PCR på toskallede bløddyrsvævet i sin helhed (50). Ved denne reduktion af prøvematerialet reduceres også mængden af PCR-inhibitorer.

Fordel ved RT-PCR

Antigen capture RT-PCR har, som tidligere nævnt, den fordel at hele viruspartikler fanges af antistof. Problemet er imidlertid, at der ikke er beskrevet et antistof rettet mod en bred række af Norwalk virus i denne litteratursøgning og gennemgang.

Enterovirus som indikator

Enterovirus er en mulig kandidat som indikator for tilstedeværelse af human enteriske virus i toskallede bløddyr, idet der er fundet primere, som kan detekterer en bred række af virus inden for genus (38).

Andre alternativer

Adenovirus, bakteriofager, og andre virus kan være mulige alternativer. Fremtidig forskning på området bør fokusere nærmere på muligheden for anvendelse af indikatorvirus til evaluering af humane enteriske virus forekomst i toskallede bløddyr, vand og relaterede miljøprøver.